Selection of Superior Strains from Collected Ear Mushrooms for Artificial Cultivation and Their Optimal Condition of Mycelial Growth

시험계통 및 재배특성 검정

버섯 전이요소 연구를 위한 균주는 P. eryngii KNR2312을 사용하였다. 고체배양에는 MCM 배지(yeast extract 2 g/L, peptone 2 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, KH2PO4 0.46 g/L, K2HPO4 1 gL, glucose 20 g/L, sucrose 20 g/L, agar 20 g/L)를 사용하였고, 액체배양에는 PDB 배지(Ventech Bio Co., Korea)를 사용하였다. 전이요소의 클로닝을 위한 숙주 세포로 Escherichia coli DH5α를 사용하였다.

버섯 genomic DNA 및 RNA 추출

수집 균주의 재배적 특성을 조사하기 위하여 국내외 균주분양센터에서 목이 17균주, 털목이 1균주 등, 총 18균주(Table 1)를 분양 받아 PDA배지에서 25ºC에 배양한 후 사용하였다. 시험 균주의 인공재배를 위하여 참나무톱밥과 밀기울을 부피비 8:2의 비율로 혼합하여 수분함량을 65%로 조절한 후, 배지량 1 kg 내외를 내열성 비닐봉지에 담아 121ºC에서 90분간 고압 살균하였다. 살균이 끝난 후 배지당 톱밥종균을 20~30 g씩 접종한 후 22ºC에서 40일간 배양하였다. 수집 계통에 대한 특성검정은 배양이 완료된 배지를 약 18~20ºC의 생육실에서 봉지 옆면에 길이 약 10 cm의 칼집을 내어 버섯발생을 유도하였으며 발생된 자실체의 수량 및 형태적 특성을 조사하였다(Fig. 1A). 선발된 우량 계통에 대한 생산력 검정은 배양이 완료된 배지에 버섯의 발생량을 높이기 위하여 4지점을 세로로 길게(약 15 cm) 칼집을 내어 버섯 발생을 유도하였으며 2주기까지 버섯 수확량을 조사하였다(Fig. 1B).

Fig. 1. The induction methods of fruiting in ear mushroom by knife skretch. Characterization of collected strains carried out as a A, and cultural characteristics and yields of selected superior strain was performed as a B.

균사생장 적합 배지 선발

배지의 종류가 균사생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Cz(Czapek Dox, Difco), GPYM(glucose 0.1%, peptone 0.1%, yeast extract 0.1%, malt extract 0.15%), MCM (mushroom complete medium, Difco), MYP(malt extract 0.03%, yeast extract 0.03%, peptone 0.05%), PDA(potato dextrose agar, Difco) 등 5종을 사용하였으며, 균사생장정도는 배지 분주 후 살균한 셀로판지를 배지 위에 깔고 그 위에 균을 접종하여 25ºC에서 12일간 배양하여 균사생장 길이와 생중량을 측정하였다. 액체배지에서는 100 ml 삼각플라스크에 배지를 20 ml씩 분주하여 121ºC에서 20분간 살균하고 균을 접종한 후 25ºC에서 14일간 진탕배양하여 여과지로 여과한 후 50ºC에서 2일간 건조하여 건조중량을 측정하였다.

균사배양 적합 탄소원 및 질소원 선발

Cz배지에서 sucrose 대신에 탄소원을 3%(w/v)첨가하여 121ºC에서 20분간 살균하여 배지를 제조하였다. 탄소원으로 단당류는 glucose, galactose, xylose, fructose 이당류는 maltose, sucrose, lactose 다당류로 starch, malt extract, xylan을 첨가하였다. 질소원은 Cz배지로 해서 NaNO₃ 대신에 질소원을 0.3%(w/v)첨가하여 배지를 제조하였다. 시험에 사용된 질소원으로 무기태NaNO₂, NaNO₃, NH₄Cl, NH₄NO₃, 유기태 yeast extract, peptone, urea, tryptone을 사용하였다.

균사배양 적합 C/N율 선발

선발된 질소원 peptone을 고정하고 탄소원으로 fructose 첨가량을 조절하여 C/N율을 10~50 범위에서 5수준으로 배지를 제조하였다. 배지 분주 후 그 위에 균을 접종하여 25ºC에서 14일간 배양 후 거름종이(Whatman No. 2)에 걸러 50ºC에 2일 건조한 후 건물중을 측정하였다.

수집균주의 재배 및 형태적 특성

본 시험에 사용된 균주는 경기도농업기술원에서 수집한 균주 9균주, 인천대학교 야생버섯균주은행으로부터 분양받은 9균주로(Table 1), 국내수집균주는 10균주, 중국 수집 균주는 5종, 기타 태국, 체코, 방글라데시 균주가 각각 1균주 포함되어 있다. 목이 수집계통의 자실체의 특성을 봉지재배로 재배 시험한 결과 Table 2 및 Fig. 2와 같다. 수집 균주 가운데 중국 수집 5계통, 인천대 수집 6계통, 국내 수집 4계통, 기타 방글라데시, 북한 수집 1계통에서 버섯발생이 이루어졌다.

Table 2. Cultural characteristics and yields in the bag cultivation according to collected ear mushroom strains

¹⁾Hunter’s color value: L(lightness), a(redness), b(yellowness).

Fig. 2. Molphological characteristics of collected ear mushrooms. Isolate 43007(black strain), 43009(white strain) and 43035(purplestrain) were selected as super strains for cultivation of ear mushrooms.

초발이 소요일수는 18~30일, 생육일수는 14~25일, 총 재배기간은 92~115일로 나타났으며 계통 중에서는 43007, 43009계통이 초발이 소요일수 18일, 생육일수 14~15일로 전체 재배기간이 92~93일로 가장 빨랐다. 수집 균주별 수량은 43007균주가 98.3 g으로 가장 높고, 43009, 43017, 43025, 43035 균주가 60 g 이상의 수량을 보여주었다. 자실체 색도 측정에서 갓색이 가장 진한 계통은 43007균주로 명도(L)가 20.4로 나타났으며, 황색도(b)가 높은 균주는 43014로 나타났다.

수집계통의 형태적 특성을 종합하여 분류한 결과 Table 3과 같다. 갈색계통은 명도 25 이상으로 43005 등 총 9계통이었으며, 흑색계통은 명도 24 이하로 43007 등 총 5계통, 백색계통은 43009균주 1계통, 털목이 43035균주 1계통이었으며, 기타 2계통(43001, 43025)은 각각 외국에서 수집된 균주로 자실체가 딱딱한 목질성을 띄기 때문에 향후 형태학 및 분자생물학적 분류 등의 정확한 분석이 필요할 것으로 판단된다.

Table 3. The classification of ear mushroom strains according to the pileus color

¹⁾Color degree: L(lightness), a(redness).

목이 수집균주별 생육특성 및 수량 분석결과, 갈색계통은 수량이 60 g 미만으로 낮았으며, 흑색계통 가운데 43007균주는 수량이 98.3 g으로 높고, 재배기간도 93일로 짧아 우량계통으로 선발하였다. 또한 백색계통 43009균주와 털목이 43035균주는 개체당 수량이 60 g 이상 비교적 높고, 기존 시장에서 볼 수 없는 계통으로 향후, 차별화 및 틈새시장의 공략을 위해 재배가 유망한 품종이라 판단되어 본 시험에서는 3계통을 선발하였다(Table 2, Fig. 2).

Table 4는 선발 우량계통에 대하여 생산력 검정을 위하여 재배특성 및 수량을 나타내었다. 초발이 소요일수는 흑색계통과 백색계통이 18일로 짧았고 털목이는 22일로 4일 길었다. 그러나 생육일수의 경우 흑색계통이가 16일, 백색계통이 25일, 털목이가 35일로 계통별로 많은 차이를 보였다. 봉지당 수량은 2주기 까지 조사한 결과 백색계통 43009 균주가 봉지당 수량이 289 g으로 가장 높았으며, 흑색계통은 1주기만 수확이 가능하였으며 196 g으로 나타났다. 털목이는 2주기까지 수확량이 182 g으로 가장 낮은 것으로 나타났다. 수집계통의 균주특성시험과 선발계통의 생산력검정 시험에서 시험균주가 같음에도 불구하고 초발이일수 등의 재배기간과 수량에서 다소 차이가 났다. 이러한 이유는 수집계통의 균주특성 시험에서는 배양일수를 60일로 두고 동시 발이작업(Fig. 1 참조)을 통해 수량성을 검정하였으나, 생산력검정에서는 재배기간의 단축을 위해 배양기간이 50일로 짧아지고, 또한 수량성을 높이기 위해 버섯 발생부위 4부위를 늘렸고 아울러 버섯발생을 2주기까지 유도한 결과이기 때문이다. 한편, Jo등[2]의 연구에 따르면 톱밥 봉지재배에 의한 흑색계통 BAA-01목이의 수량은 275~350 g으로 나타났는데, 본 연구의 선발 흑색계통의 수량은 이보다 낮았고, 백색계통은 이와 비슷하였다.

선발균주의 균사생장 최적 조건

목이 수집균주 가운데 선발된 계통에 균사생장에 적합한 배지를 선발하기 위하여 PDA등 5종의 배지에서 균사생장을 측정한 결과(Table 5), 흑색계통의 43007균주는 MCM배지에서 균사생장 63 mm, 균체중량 452 mg, 백색계통의 43009균주는 GPYM배지에서 균사생장 78 mm, 균체중량이 472 mg으로 우수하였다. 털목이 계통의 43035균주의 GPYM, CZ, MCM, MYP배지가 87 mm로 배양 10일만에 완료된 것으로 나타났으나 건조중량 조사결과 균사의 밀도가 차이가 있었고, 그 중에서 GPYM배지가 686 mg으로 가장 우수하였다.

Table 4. Cultural characteristics and yields of selected ear mushroom strains

Table 5. Mycelial growth of selected ear mushroom strains on the different culture media

^a-dDifferent superscript letters within the same row indicate significant differences among treatments by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Table 6. Effect of temperature on mycelial growth of selected ear mushroom strains

^a-dDifferent superscript letters within the same row indicate significant differences among treatments by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Table 7. Effect of carbon source on mycelial growth of selected ear mushroom strains

^a-dDifferent superscript letters within the same row indicate significant differences among treatments by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Table 8. Effect of nitrogen source on mycelial growth of selected ear mushroom strains

^a-dDifferent superscript letters within the same row indicate significant differences among treatments by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Table 9. Effect of C/N ratio on mycelial growth of selected ear mushroom strains

^a-dDifferent superscript letters within the same row indicate significant differences among treatments by Duncan’s multiple range test (p<0.05).

Table 6은 목이 선발계통에 대하여 배양온도에 따른 균사 생장량을 측정한 결과, 43007 균주는 30ºC에서 균사생장 84 mm, 균체 중량 408 mg으로 우수하였다. 48007 균주는 25ºC와 30ºC에서 균사생장이 12일 만에 완료되고, 균체중량도 각각 402, 418 mg으로 우수하였다. 그러나 35ºC 이상에서는 균사생장이 급격히 떨어지는 것으로 나타나 35ºC 이상의 고온배양은 피해야 할 것으로 판단된다. 털목이 계통의 43035 균주는 25, 30ºC에서 균사생장 10일 만에 87 mm 완료되었으나 균체 중량은 30ºC에서 654 mg으로 더 높게 나타났다.

Table 7은 선발균주별 탄소원에 따른 균사 생장량을 측정한 결과, 흑색계통의 43007균주는 maltose, glucose, fruc- tose에서 균사 생장량 206~234 mg으로 높은 것으로 나타났다. 백색계통의 43009균주는 fructose에서 균사 생장량이 510 mg으로 가장 높고, 털목이 계통의 43035균주는 glucose에서 347 mg으로 균사 생장이 많았다. 다당 가운데 43007균주는 starch와 xylan의 균사생장량의 차이가 없었으나, 43009균주와 43035균주는 starch가 xylan에 비해 균사생장량이 높았다.

목이 균사생장에 대한 탄소원에 대한 영향 연구에서 Yu 등[5]은 흑설탕을, Xu와 Yun[6]은 sucrose, Jonathan 등[7]은 glucose를 선발하였는데, 전체적으로 목이의 탄소원으로는 단당 및 이당류가 다당류보다 적합하였다.

질소원에 따른 선발계통별 균사생장량(Table 8)은, 선발균주 모두 peptone에서 935~952 mg으로 다른 질소원에 비해 월등하게 높은 것으로 나타났다. Jonathan 등[7]과 Hong 등[8]의 연구에서도 목이 및 털목이의 균사배양에서 질소원으로 peptone을 선발하였는데 따라서, 목이의 균사체 대량생산을 위한 질소원으로 peptone을 사용하는 것이 적합할 것으로 판단된다.

균사체 생장을 위한 C/N율을 검정한 결과(Table 9), 흑색계통의 43007균주는 C/N율 10에서 균사생장길이 55.4 mm로 가장 우수했으며, 백색계통 43009와 털목이 43035 균주는 C/N율 10과 20에서 80~87 mm로 높은 것으로 나타났다. 털목이 계통의 43035 균주는 C/N율 20에서 균사생장이 87 mm로 가장 높아, 균주별로 다소 차이가 있었다.