Comparison of Ingredients and Antioxidant Activity of the Domestic Regional Wolfiporia extensa

복령 시료의 수집

지역별(강원도, 경상도, 전라도)로 매립 재배되는 복령의 성분을 분석 비교하기 위하여 지역별로 상품화되고 있는 복령을 구입하여 사용하였다. 구입한 백복령은 분쇄기를 이용해 50 mesh 이하로 균질화한 후 건조 후에 시험에 이용하였다.

원소분석

복령을 구성하는 화합물의 원소 C (탄소), H (수소), N(질소), O (산소)을 분석하기 위하여 경북대학교 공동실험실습관에서 일반 원소분석기 Elemental Analyzer (EA1110; CE Instruments, Wigan, England)를 이용하여 정성 및 정량분석 하는데 사용하였다. 매립 복령의 생장에 가장 많이 미치는 요소는 토양이며 토양에 따라 시료를 판별하고자 금속성분의 차이를 확인하였다. Elemental Analyzer의 분석 조건은 아래 Table 1과 같다.

Table 1. Operating condition and data acquisition parameters for elemental analyzer

^aTCD, thermal conductivity detector.

성분 분석

복령이 가지고 있는 극미량의 무기질 성분과 중금속 함유량을 측정하기 위해 경북대학교 공동실험실습관에서 유도 결합 플라즈마 질량분석기(inductively coupled plasmamass spectrometry; ICP, optima 7300 DV; PerkinElmer,Waltham, MA, USA)를 이용하여 각 원소별 농도 분석을 실시하였다. ICP 분석 조건은 아래 Table 2와 같다.

Table 2. Operating conditions and data acquisition parameters for ICP-MS^a

^aICP-MS, inductively coupled plasma-mass spectrometry.

Gas chromatograph-Mass spectrometry 분석

생리활성에 많은 영향을 줄 수 있는 복령추출액의 휘발성분의 비교를 위하여 용매추출물을 gas chromatographymass spectrometry (GC-MS)를 이용하여 분석을 실시하였다. 복령추출액의 GC-MS 분석을 위해 경북대학교 공동실험실습관에서 Agilent 7890A gas chromatography (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)와 5975 GC-MS selectivedetector (Agilent Technologies)을 이용하여 측정하였다

복령추출액의 분석을 위한 칼럼은 30 m length × 0.25mm the identifier (i.d.) and 0.25 ×m film thickness fused silica capillary column Agilent J&B DB-5MS을 사용하였다. 칼럼 온도는 70^oC에서 1분간 유지, 300oC까지 분당 5^oC씩 승온하면서 300oC에서 20분 유지하였고 총 분석시간은67분이었다. 주입구 및 검출기의 온도는 250^oC로 하였고,헬륨을 carrier gas로 사용하여 분당 1 mL의 유속을 유지하였다. 주입방법은 splitless 모드로 하여 주입하여 분석하였다. Mass selective detector의 이온화 에너지는 70 eV, scanning mass range는 10~800 m/z으로 하였다.

Radical 소거능 측정

지역별 복령추출물의 항산화 활성을 비교하기 위하여 건조 분말 복령 시료에 10배량 (w/v)의 50% 에탄올을 첨가후 3시간동안 환류냉각추출기를 사용하여 추출하였다.위의 과정을 통해 획득한 추출액은 지름 11 μm의 여과지(NO.1; Whatman, Piscataway, NJ, USA)로 여과한 후 진공농축기(Ilshin Lab Co., Yangju, Korea)로 감압농축하고, 농축된 추출물은 20^oC 냉동고에 보관하였고 시험 전 필터(pore size 0.45 μm filter)에 여과한 후 시험에 사용하였다.

전자공여능을 측정하기 위하여 복령 추출물의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) radical activity (electron donating abilities, EDA)는 다음과 같이 측정하였다. 즉, 메탄올에 용해된 각각의 추출액 10 μL에 0.2 mM의 DPPH 100 μL을 가하여 37^oC 인큐베이터 암실에서 30분 동안 반응한 후 517 nm 흡광도(VersaMax microplate reader; Molecular Devices, Sunnyvale,CA, USA)를 측정하였다. DPPH radical 소거 활성은 다음식에 의해 계산하였고, IC₅₀ (DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 농도)으로 나타내었다(Table 3).

DPPH radical 소거능 (%) = [(Ab − Aa) / Ab] × 100

복령추출물의 ABTS+ radical cation 소거작용 측정은 7.4mM 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid(ABTS)와 2.4 mM potassiom persulfate를 3차 증류수에 용해하여 1:1로 혼합한 후 암실에서 실온으로 15시간 이상 동안 반응시켜 ABTS+를 형성시켰다. 734 nm에서 추출액과 반응하기 전에 ABTS+ 용액의 흡광도는 0.700±0.005로 에탄올로 희석하여 하였다. 메탄올 용해 추출물 10 μL를위의 반응 용액 200 μL을 가하여 실온에서 6분간 반응시켜734 nm (VersaMax microplate reader; Molecular Devices)에서 흡광도를 측정하였다. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)는 아래의 식으로 계산하였으며, IC₅₀으로 계산하였다(Table 3).

ABTS+ radical 소거능 (%) = [(Ab − Aa) / Ab] × 100

Aa: 시료첨가구의 흡광도, Ab: 무처리구의 흡광도

Table 3. IC₅₀ of various cultured region parts of Wofiporia extensa on DPPH and ABTS radical scavenging activities

^aPositive control: ascorbic acid (1 mg/mL) for DPPH and trolox (20 mM) for ABTS and FRAP..

^bTE (μmol TE/g) = trolox (mmol/L)/sample (g/L).

Data were expressed as the means ± SD from three independent experiments..

DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid; FRAP, ferric reducing antioxidant power.

FRAP assay 환원력

Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 활성 측정은 0.2 M acetate buffer (pH 3.6)와 40 mM HCl로 용해시킨10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ)와 20 mM FeCl3·H2O를 10:1:1 (v:v:v) 비율로 사용하였다. 메탄올에 용해한 각각의 복령추출물 20 μL에 FRAP용액 100 μL를 혼합한 후 37^oC에서 30분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도 (VersaMax microplate reader; Molecular Devices) 측정하였고,IC₅₀ (DPPH radical 형성을 50% 억제하는데 필요한 농도)으로 나타내었다(Table 3). 양성대조군으로 trolox를 사용하였고 흡광도의 높은 값은 높은 환원력을 나타낸다.

통계처리

항산화 실험은 3회 반복으로 실시하여 얻은 결과로 통계분석은 SAS ver. 9.3 (SAS Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 각 측정 군의 평균과 표준 편차를 산출하고 처리간의 차이 유무를 ANOVA로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test (DMRT)을 실시(p < 0.05)하여 유의성을 검정하였다

원소분석

매립 재배법에 따른 지역별 성분 분석 비교를 위해 지역별(강원도, 경상도, 전라도) 복령의 일반 성분 분석(elemental analyzer) 결과를 아래 Table 4로 나타냈다. 3개도 복령의 일반 성분은 거의 유사하게 나타났다. 본 연구에서 얻은 성분 함량은 Oxygen 46~48%로 가장 많이 포함하고 있었고 다음으로 38~39%의 carbon, 6.05~6.1% hydrogen, 0.17~0.21% nitrogen으로 나타났다. 그리고 3가지 복령 모두에서 sulphur 성분은 발견되지 않았다. 일반 원소분석에서 경상도, 전라도, 강원도에서 매립 재배된 복령의 차이점은 발견되지 않았다. 이미 보고된 바에 의하면 토양은 버섯 생장에 많은 영향을 미치고[8] 지역별 토양의 조성(광물의 특성,pH, 온도, 수분 등)에 따라 인삼의 무기원소의 성분 차이를나타냈다[9].

이러한 것으로 보아 토양의 차이는 토양에서 자라는 식물 성분 변화의 차이를 주지만 지역별 복령에서는 성장의 특이성으로 인해 성분 변화의 차이를 주지 않은 것으로 보인다.

Table 4. Element contents of the Wofiporia extensa

DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid; FRAP, ferric reducing antioxidant power.

Inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP)분석

강원도, 경상도, 전라도 지역의 매립 재배 복령의 성분 분석 비교를 위해 ICP spectrophotometer (optima 7300 DV;PerkinElmer)를 이용하여 11종 금속 함량 분석한 결과는 아래 Table 5와 Fig. 1로 나타냈다.

모든 복령에서 11종의 중금속의 분석결과 S, Ca, Mg, P을 공통적으로 함유하고 있으며 그 외 As, Se, Cu, Fe, Pb,Zn, Cd 등 7종은 0.1 ppm 이하의 미세한 수준으로 검출되었다. 특히 모든 복령에서 Ca을 제외하고 S는 145~149ppm, Mg은 69~72 ppm, P는 122~154 ppm으로 큰 차이가 없었다. Ca은 경상도(509.98 ppm)가 강원도(210.61 ppm)와 전라도(223.88 ppm)보다 약 2~2.35배보다 많이 함유하였다. 이러한 이유는 명확하지 않으나 토양은 식물의 영양분 공급에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 추후에 토양 분석을 동시에 실시하여 비교하는 것이 필요하다. 이러한 근거로 Kwon 등[5]과 Choi 등[10]은 자연산과 재배산 복령의 무기질 성분에 대하여 비교 분석한 결과 복령은 K, Na, Ca의 함량이 높았으며, Ghazali 등[11]은 Na와 Ca은 재배산에 비해 자연산의 함량이 높게 나타났고 재배 일수가 길어 짐에 따라 Fe, Zn, Cu, Na의 함량이 증가하였으며 K, Mg, Ca의 함량은 감소하는 것으로 보고하였지만 역시 재배한 토양 분석을 제시하지 않았다.

Fig. 1. Comparison of minerals (S, Ca, Mg, P) in each Wofiporia extensa by different regional cultured origins (Gangwondo,Gyeongsang-do, Jeolla-do).

Table 5. Heavy metal and minerals in Wofiporia extensa

Gas chromatograph-Mass spectrometry (GC-MS) 분석

강원도, 경상도, 전라도 지역에서 채취한 복령에 대한 생리활성 성분을 비교하기 위하여 50% 에탄올 추출을 실시하였다. GC-MS로 분석한 결과(Table 6, 7), 모든 시료에서 oleic acid 계열의 9-octadecenoic acid 성분이 확인되었다.Oleic acid는 항염작용, 항균작용 및 암세포 성장억제 효과가 있는 것으로 알려져 있다[11,12]. 특히 강원도 복령추출액에서 50%로 가장 높은 함량을 나타내었고, 경상도 복령에서 16.4%, 전라도 복령에서 15.22% 함량을 보였다. 경상도를 제외한 강원도, 전라도 복령추출액에서 linoleic acid계열의 9,12-octadecenoic acid [13,14]와 palmitic acid 계열의 지방산 5-Hydroxymethylfurfural 성분이 확인되었다.5-hydroxymethylfurfural는 당뇨병질환 예방 효능이 알려져 있고[15], 화장품에 이미 산화방지제와 살진균제로 사용되고 있어 화장품계에서도 좋은 효능을 기대할 수 있다.강원도 복령에서 나타난hexadecanoic acid는 혈중 low-density lipoprotein (LDL) cholesterol을 높여주고, highdensitylipoprotein (HDL) cholesterol은 낮춰주는 등 심혈관 질환의 예방 효능이 알려져 있다[16].

Table 6. Phyto-components identified in the extract of Wofiporia extensa

^aRT, Retention time.

Table 7. Activity of phyto-components identified in the extract of Wofiporia extensa

Radical 소거활성

항산화 활성 측정을 위해 DPPH와 ABTS 두 가지의 측정법을 시행하여 복령 추출물의 radical 소거활성을 나타내었다. DPPH는 비교적 안정한 free radical로서, 항산화 활성을 가지는 물질이 DPPH free radical에게 전자를 공여해줌으로써 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 간단히 측정할 수 있다.

복령 추출물을 이용하여 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 2A와 같다. 추출물의 농도가 증가함에 따라 DPPH radical 소거활성이 증가하는 경향을 보였으며, 10mg/mL의 농도에서 17.87~115%로 큰 차이를 보였다. 강원도, 전라도 복령의 활성이 115%, 108%로 가장 낮은 활성을 나타낸 경상도 17.67% 활성보다 약 6~7배 높은 DPPH radical 소거활성을 보였다. 양성대조군인 1 mg/mL ascorbic acid (vitamin C)의 DPPH radical 소거활성과 비교 시 약10배 가량 활성이 낮은 것으로 나타났다. IC₅₀값은 강원도(2.97 mg/mL), 경상도(23.03 mg/mL), 전라도(4.16 mg/L)로 ascorbic acid (21 μg/mL)보다 DPPH free radical 활성이 현저히 낮은 것으로 나타났다. ABTS+ decolorization assay는 potassium persulfate와 ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)의 산화에 의해 free radical을 형성시킨 후 각각의 시료에 대한 free radical 소거능을 측정함으로서 항산화 활성을 확인할 수 있다. TEAC방법을 이용하여 측정한 복령 추출물의 ABTS+ radical을 측정한 결과는 Fig. 2B와 같다. 복령 추출물 농도 10 mg/mL의 농도에서 각각 강원도(83.7%), 경상도(25.5%), 전라도(62.15%)의 활성을 나타내어 강원도, 전라도, 경상도 순으로 ABTS+ radical 소거활성이 높게 나타났다. 이는 DPPH나타낸 경상도 17.67% 활성보다 약 6~7배 높은 DPPH radical소거활성을 보였다. 양성대조군인 1 mg/mL ascorbicacid (vitamin C)의 DPPH radical 소거활성과 비교 시 약10배 가량 활성이 낮은 것으로 나타났다. IC₅₀값은 강원도(2.97 mg/mL), 경상도(23.03 mg/mL), 전라도(4.16 mg/L)로 ascorbic acid (21 μg/mL)보다 DPPH free radical 활성이 현저히 낮은 것으로 나타났다. ABTS+ decolorizationassay는 potassium persulfate와 ABTS (2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)의 산화에 의해 free radical을 형성시킨 후 각각의 시료에 대한 free radical 소거능을 측정함으로서 항산화 활성을 확인할 수 있다. TEAC방법을 이용하여 측정한 복령 추출물의 ABTS+ radical을 측정한 결과는 Fig. 2B와 같다. 복령 추출물 농도 10 mg/mL의 농도에서 각각 강원도(83.7%), 경상도(25.5%), 전라도(62.15%)의 활성을 나타내어 강원도, 전라도, 경상도 순으로 ABTS+ radical 소거활성이 높게 나타났다. 이는 DPPH 로 측정한 결과와 비슷한 경향을 나타냈다. IC₅₀값은 강원도(3.54 mg/mL), 경상도(12.17 mg/mL), 전라도(7.40 mg/mL)로 양성대조구인 trolox (1.78 mg/mL)와 유사한 활성을 나타내었으나 농도대비 radical 소거활성은 상대적으로 2.5~7배 정도 낮았다. 이를 trolox equivalent capacity로 변환시 각각 530.7 μmol TE/g (강원도), 128.9 μmol TE/g (경상도), 356.8 μmol TE/g (전라도)로 나타났다. 두 가지 측정법의 결과를 비추어 보아 강원도, 전라도 추출물의 free radical 소거활성이 경상도에 비해 좋은 것으로 확인되었다.

복령의 triterpene류는 항염증, 항피부암, 항구토 등의 항암활성이 보고되고 있으며[6,17], 복령의 triterpene 함량은 복령의 색도와 상관성이 있는 것으로 보고된 바 있다[18]. 시료 무처리구의 색도를 살펴보면 강원도, 전라도 복령의 추출물은 갈색을 띄고 있고 경상도 복령 추출물은 투명색을 나타낸다. Radical 소거활성 결과를 종합해 보면, 복령의 triterpene과 색도가 radical 소거활성의 주요 물질로작용하여 항산화력에 영향을 미친다는 것을 예측해 볼 수있다.

Fig. 2.DPPH (A) and ABTS (B) radical scavening activities (%) of dependent on various cultured regions and concentration from extracts of Wofiporia extensa. Data were expressed as the means ± SD from three independent experiments. Different superscripts indicate significant different among group at p < 0.05. DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl; ABTS, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid.

FRAP assay

FRAP assay는 colored ferrous tripyridyl triazine complex에의해 ferric ion이 ferrous로 전환되는 과정을 분석함으로써 항산화력을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridyltriazine (Fe³⁺-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine (^Fe2+-TPTZ)으로 환원되는 원리를 이용한 것이다[19]. 복령 추출물을 이용하여 FRAP assay에 의한 항산화 활성을 측정한 결과는 Fig. 3와 같다. 환원력에서의 흡광도 수치는 그 자체가 시료의 환원력을 나타내며, 높은 항산화 활성을 가질수록 흡광도의 수치가 높게 나타난다. 앞의 DPPH와 ABTS 실험결과와 동일하게 농도 증가에 따른 항산화 활성의 비례적인 증가를 나타내었고, IC₅₀값은 강원도(6.585mg/mL), 경상도(19.06mm/mL),전라도(18.97mg/mL)로 양성대조구 강원도 복령은 trolox(5.121 mg/mL)와 유사한 항산화력을 나타내었고, 경상도 전라도는 약 3~4배 낮은 것으로 확인되었다. 이를 trolox equivalent capacity로 변환시 각각 294.15 μmol TE/g (강원도), 321.47 μmol TE/g (경상도), 321.4 μmol TE/g (전라도)로 나타났다.

Fig. 3. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay of dependent on various cultured regions and concentration from extracts of Wofiporia extensa. Data were expressed as the means ± SD from three independent experiments. Different superscripts indicate significant different among group at p < 0.05