서론
현대농업에서 화학농자재의 개발 및 사용은 농업생산량 증대에 필수적 요소 중 하나이다. 그러나 수십 년 동안 계속된 화학농자재 사용으로 토양의 물리성 및 화학성이 파괴되었으며, 특히 경종부분에서 환경파괴와 유해 화학물질의 농산물 축적 등 환경문제와 함께 사회적 문제로 인식되고 있다. 이런 상황에서 유기농업은 현대 화학농업의 문제점을 보완하고, 지속 가능한 농업의 대안으로 여겨지고 있다. 유기농업이란 화학비료, 유기합성농약(농약, 생장조절제, 제초제) 등 일체의 합성 화학물질을 사용하지 않고 유기물과 자연광석, 미생물, 천적 등 친환경적 자재를 사용하는 농법으로 자연과 생태적 공생관계를 유지하는 농업을 말한다. 유기농업은 자연생태계와 환경의 회생이라는 관점에서 그 중요성을 더하고 있다. 미생물을 이용한 유기농업 분야는 미생물 비료, 미생물 농약 등으로 구분할 수 있는데, 이는 토양 내 미생물이 생장하면서 분비하는 호르몬,항생물질 등 2차 대사산물을 이용한 것이다. 그 중 미생물을 식물에 접종하거나 식물 근권에 처리하였을 때 병 발생을 억제하거나 병 발생과 진전 속도를 감소시키는 것을 길항작용(antagonism)이라 한다. 이는 어떤 상반되는 2가지 요인이 동시에 작용하여 서로 그 효과를 상쇄시키는 작용을 말하며, 병원균과 비병원성 균의 경쟁 및 타감작용의 결과로 생각된다. 그 밖에도 미생물이 생장 중 분비하는hydrogen cyanide (HCN), antibiotics 등의 물질과 chitinase,protease 등과 같은 다양한 효소의 작용으로 길항작용이 나타난다고 알려져 있다. 어떤 미생물은 진균의 세포벽주요 구성물질인 chitin을 분해하는 chitinase를 분비하여 진균의 균사를 파괴하거나, 생장을 억제함으로써 병원성 진균에 의한 식물병해를 억제한다는 연구가 보고되어 있다[1]. 또한 미생물의 생장 중 분비하는 volatile compounds의 영향으로 식물병원성 진균의 생장이 억제된다는 연구도 보고되어 있다 [2]. 이러한 식물병 발생 억제 기작은 유용미생물이 진균 및 세균 병을 억제시키는 동시에 식물체의 defence pathway를 활성화시켜 pathogen related gene을 발현시킴으로써 병에 대한 저항성을 획득하는 것으로 연구되어 있다 [3]. 이러한 식물체의 병원성 미생물에 대한 방어기작을 전신획득저항성(induced systemic resistance, ISR)이라하는데 최근 연구에 따르면 비병원성 식물생장 촉진 미생물인 Bacillus cereus를 식물체에 접종했을 때 salicylate dependent signaling pathway와 jasmonate/ethylene dependent signaling이 동시에 활성화되어 강력한 저항성이 유도된다고 보고되어 있다. 또한 비병원성 미생물을 접종했을때 priming이라는 단계를 거치면서 병원성 미생물이 식물에 침투했을 때 좀더 빠르고 강하게 저항성을 유도한다는 연구가 보고된 바 있다[4].
본 연구는 다양한 기주에 탄저병 및 모잘록병 등 식물병을 유발하는 Colletotrichum acutatum, Colletotrichum coccodes,Colletotrichum gloeosporioides,Colletotrichum demantium,Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Sclerotinia minor, Fusarium sp.에 대해 식물 근권에서 분리한 미생물이 가지는 식물병 억제 능력을 평가하고, 식물병 억제 원인물질을 구명하여 유기농업을 위한 천연 미생물제제로 실용화하는데 그 목적이 있다.
재료 및 방법
미생물의 선발 및 동정
본 연구에서 사용한 균주는 인천시 강화군, 소백산, 오갑산의 식물 근권에서 토양을 수집하여 희석평판법으로 분리하여 실험에 사용하였다. 토양시료를 10-6까지 희석하고 tryptic soy agar (TSA) 배지에 20 μL 분주, 도말하여28oC에서 3일간 배양하였다. 배양 후 각각의 토양에서 colony의 모양, 색, 중심부의 형태, 주변부의 형태 등 형태학적으로 다른 특성을 가진 균주를 순수 분리하여 실험에 사용하였다.
식물병원성 진균 생장억제 능력 검정
최종 선발된 균주의 식물병원성 진균에 대한 생장억제 능력을 평가하고자 식물병원성 진균과 대치배양을 실시하였다. TSA, potato dextrose agar (PDA) 그리고 TSA, PDA를 각각 1:1로 혼합한 배지를 사용하였으며, 식물병원성 진균은 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection,KACC)에서 분양받은 Colletotrichum acutatum, C.coccodes, C. gloeosporioides, C. dematium, Botrytis cinerea,Rhizoctonia solani, Sclerotinia minor, Fusarium sp.를 사용하였다(Table 1). 식물병원성 진균을 직경 3 mm의 agar plug 형태로, 유용미생물은 paper disk법으로 접종하였다.그 후28oC에서 진균만 접종한 무처리 대조구가 직경 90mm 되도록 배양한 후 식물병원성 진균과 유용 미생물 간의 거리를 측정하여 억제율(inhibition rate)로 환산하였다. 각각의 실험은 10 plate씩 3반복으로 수행하였다.
Inhibition rate (%) = (R – r)/R× 100
Where, R is the maximum radius of the fungal colony away from the bacterial colony; r is the radius of the fungal colony opposite the bacterial colony.
식물병원성 진균 생장억제 능력 검정
분리균들이 2차 대사산물로 chitinase의 분비 여부를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 사용된 colloidal chitin의 제조는 crab-shell chitin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA) 20 g을 HCl 350 mL에 녹이고 4oC의 냉장고에서 24시간 동안 정치 후 거즈로 filtering 하여 2 L의 차가운 ethanol (20oC)에 빠르게 혼합하였다. 얻어진 chitin 현탁액을 10,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상청액은 버리고 pellet은 pH 7.0이 될 때까지 멸균수로 세척하였다. 그 후 pellet을 동결 건조하여 colloidal chitin을 제조하였다.제조한 colloidal chitin은 20oC에서 보관하면서 사용하였다.Chitinase의 분비를 확인하기 위해 TSA 배지에 colloidal chitin 2% (w/v)를 첨가하여 배지확산법을 이용, clear zone을 측정하여 chitinase의 분비 여부를 확인하였다[5].
Protease 생성 조사
분리균의 2차 대사산물로 protease의 분비를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 2% skim milk agar 배지 중앙에 지름 8 mm의 well을 만들어 액체 배양한 균주를 접종 후 30oC에서 4일간 배양하였다. Protease의 분비는 미생물을 접종한 well 주변부의 clear zone 생성 여부로 확인하였다.
인산가용화(phosphate solubilizing) 조사
인산가용화 가능 여부는 Pikovskaya (PVK) agar [6] 배지를 이용하여 실험하였다. PVK 배지(yeast extract 0.5 g,dextrose 10 g, Ca3(PO4)2 5 g, (NH4)2SO4 0.5 g, KCl 0.2 g,MgSO4 0.1 g, MnSO4 0.0001 g, FeSO4 0.0001 g, agar 15 g,distilled water 1 L)에 토양에서 분리한 균주를 획선 접종하였다. 접종 후28oC에서 10일 동안 배양하였다. 미생물의 난용성 인산 가용화 여부는 halo zone의 여부로 확인하였다.
Siderophore 생성 조사
Siderophore의 생성 여부는 chrome azurole S (CAS) 배지를 이용하여 실험하였다 [7]. CAS 배지에 분리균을 접종한 후28oC에서 7~10일간 배양하였다. siderophore의 생성 여부는 halo zone의 여부로 확인하였다.
Hydrogen Cynide (HCN) 생성 조사
HCN의 생성 여부는 토양에서 분리한 미생물 균주를 glycine(4.4 g/L)이 첨가된 TSA 평판배지에 접종한 후 0.5%(w/v) picric acid와 1% Na2CO3를 혼합한 solution에 멸균한 100 mm filter paper를 침지시킨 후, petridish의 뚜껑에 부착시켜 sealing 하였다. 그 다음28oC에서 7일간 배양하여 뚜껑에 부착된 filter paper의 색이 yellow에서 redbrown으로 변화하는 것으로 HCN의 생성 여부를 확인하였다.
Scanning Electron Microscope Assay
토양에서 분리된 미생물이 진균의 균사 형태에 미치는 영향을 알아보기 위해 주사전자현미경 촬영을 하였다. 선발 세균 PA2와 식물병원성 진균 Colletotrichum acutatum을 대치배양 하였다. 배양 후 형성된 생육저지선을 중심으로 균사가 자란 agar plug를 잘라 시료 부피 10배의 glutaraldehyde solution (25% glutaraldehyde, 0.1 M sodium phosphate buffer (SPB), tween 80)을 넣어 고정시켰다. 그후 SPB에 20분간 침지하여 2번 세척하였다. 세척 후 30% /50% / 70% / 95% ethanol로 각각 1회씩, 100% ethanol로 2회 탈수시켰다. 탈수 시킨 후 시료의 변형을 줄이기 위해임계점 건조법(critical point drying method; CPD)으로 건조시킨 후 주사전자현미경으로 균사의 형태를 관찰하였다.
식물병 억제효과 생물검정
토양분리 미생물들이 식물병원성 진균의 생장억제 효과를 확인하기 위하여 pot 상에서 식물병원성 진균의 생장 억제 실험을 실시하였다. 식물병원성 진균은 다양한 기주에 균핵병을 일으키는 Sclerotinia minor와 모잘록병, 뿌리썩음병, 줄기썩음병을 일으키는 Rhizoctonia solani를 대상으로 실험하였다. 처리구는 미생물을 먼저 처리한 후 식물병원성 진균을 처리하는 것과 식물병원성 진균을 먼저 처리한 후 미생물을 처리하는 두 가지 처리구와 수분만 공급하는대조구로 구분하였다. 각각의 식물병원성 진균은 2 × 104 spores/mL의 포자현탁액을 만들어 접종하였으며, 길항세균은 2 × 107 spores/mL의 농도로 식물체에 관주 처리하였다.
결 과
미생물의 선발 및 동정
유용미생물을 선발하기 위하여 소백산, 강화, 오갑산에서 수집한 토양으로부터 미생물을 순수 분리하여 colony 형태학적으로 서로 다른 특징을 갖는 41균주를 선발하였다(Table 2). 1차 분리 균주를 대상으로 식물생장촉진 능력을 갖는 미생물을 선발하고자 식물체에 처리한 결과 시금치등 9 작물의 생장촉진효과가 우수한 5균주의 세균을 최종선발하였으며, 각각 PA1, PA2, PA4, PA5, PA12로 명명하였다. 이 5균주를 16S rDNA로 염기서열을 분석한 결과 Bacillus subtilis, Bacillus altitudinis, PaeniBacillus polymyxa,Bacillus amyloliquefaciens 임을 확인하였다(Table 1).
미생물의 식물병원성 진균 생장억제 능력 검정
토양에서 분리한 5균주가 가지는 식물병원성 진균의 생장 억제 효과를 확인하기 위하여 각 균주를 Colletotrichum acutatum, C. gloeosporioides, C. coccodes, C. dematium,Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Sclerotinia minor, Fusarium sp.와 PDA, TSA, PDA와 TSA 혼합배지(v/v, 1:1)에서 대치배양하여 길항성을 확인하였다. 그 결과 PDA 배지에서는 5 균주 모두 탄저병 균의 균사생장을 높은 수준에서 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 그 중 특히 PA1은 C.coccodes의 균사생장을 58% 억제하여 높은 억제율을 보였고, PA2는 C. dematium에 60%, PA4 역시 C. coccodes의 균사생장을 48.5% 억제하는 것을 확인하였다. 또한 PA5는 B.cinerea와 Fusarium sp.의 균사생장을 48% 억제하였고, PA12는 C. coccodes의 균사생장을 64% 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 또한 유용미생물 5균주는 각각 R. solani, B.cinerea, S. minor, Fusarium sp.의 균사생장을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 1). TSA 배지에서는 PDA 보다 균사생장 억제 효과가 좋았으며, 다양한 식물병원성 진균에서 좀 더 높은 균사생장 억제를 보였다(Fig. 2). PA1, PA2, PA4,PA5 그리고 PA12는 식물에 균핵병을 일으키는 S. minor에 각각 94.5%, 96.5%, 95%, 67.5%, 91.5%로 높은 균사생장 억제율을 보였다(Fig. 2). 그 밖에도 토양에서 선발한 유용미생물 5균주는 각각 R. solani, B. cinerea, S. minor, Fusarium sp.의 균사 생장 억제 능력은 PDA 배지에서 대치배양 결과보다 TSA 배지에서 대체배양 했을 때 더 높은 억제율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. PDA와 TSA 배지를 1:1로 혼합한 배지에서는 PA1은 C. acutatum에 대하여 52%의 균사생장 억제율을 보였으며, PA2 역시 같은 식물병원성 진균에 58.5%의 균사생장 억제율을 보였다. PA4는 B. cinerea의 균사생장을 43% 억제하였고, PA5는 C. acutatum을 53%, PA12는 C. coccodes를 58% 억제하였다(Fig. 3).
Fig. 1. Dual culture assay on potato dextrose agar medium for In vitro inhibition of mycelial growth of various plant fungal pathogens by selected bacterial isolates. C.a, Colletotrichum acutatum; C.g, C. gloeosporioides; C.c, C. coccodes; C.d, C. dematium;R.s, Rhizoctonia solani; B.c, Botrytis cinerea; S.m, Sclerotinia minor; F.sp, Fusarium sp.
Fig. 2. Dual culture assay in tryptic soy agar medium for In vitro inhibition of mycelial growth of various plant fungal pathogens by selected bacterial isolates. C.a, Colletotrichum acutatum; C.g, C. gloeosporioides; C.c, C. coccodes; C.d, C. dematium; R.s, Rhizoctonia solani; B.c, Botrytis cinerea; S.m, Sclerotinia minor; F.sp, Fusarium sp.
Fig. 3. Dual culture assay in potato dextrose agar and tryptic soy agar combination medium for In vitro inhibition of mycelial growth of various plant fungal pathogens by selected bacterial isolates. C.a, Colletotrichum acutatum; C.g, C. gloeosporioides; C.c,C. coccodes; C.d, C. dematium; R.s, Rhizoctonia solani; B.c, Botrytis cinerea; S.m, Sclerotinia minor; F.sp, Fusarium sp.
Chitinase 생성 활성
진균의 세포벽 주성분인 chitin을 분해하는 chitinase의 분비를 확인하기 위하여 colloidal chitin medium을 만들어 실험하였지만 본 실험에서 사용된 유용미생물 5균주는 모두 chitinase를 분비하지 않는 것을 확인하였다
Protease 생성 활성
토양에서 분리한 5균주가 단백질 분해효소를 분비하는지 확인하기 위하여 2% skim milk agar 배지에 접종하여 halo zone의 여부를 실험한 결과 5균주 모두 protease를 분비하는 것을 확인하였다(Fig. 4).
인산가용화(phosphate solubilizing) 활성
토양에서 분리한 5균주의 세균이 난용성 인산을 가용화 할 수 있는지 확인하기 위하여 PVK agar 배지에서 인산가용화 실험을 실시하였다. 인산가용화 실험을 실시한 결과 5균주 모두 colony 주변에 halo zone이 관찰되어 난용성 인산을 가용화시킬 수 있는 것으로 판단하였다(Fig. 5).
Siderophore 생성
토양에서 분리한 세균의 Siderophore 생성 여부를 확인한 결과 5 균주 중 PA1, PA2, PA4, PA12가 siderophore를 생성하였고, 그 중 PA2가 가장 많은 siderophore를 생성하는 것을 확인하였다(Fig. 6).
Hydrogen cynide (HCN) 생성
토양에서 분리한 5균주가 hydrogen cyanide를 생성하는지 확인하기 위해 실험을 실시하였다. HCN 생성 여부를 확인한 결과 0.5% picric acid와 1% NaCl solution에 침지시킨 filter paper의 색이 brown-red color로 변한 것으로 보아 PA1, PA2, PA12가 HCN을 생성하는 것으로 확인하였다(Fig. 7).
길항균 처리에 따른 탄저병균의 형태적 변화
토양에서 분리한 유용미생물 PA2와 탄저병균 Colletotrichum acutatum을 대치배양하였을 때 형성되는 저지선 부분의 균사 형태를 scanning electron microscope (SEM)로관찰하였다. 그 결과 무처리군의 균사와 PA2와 대치 배양하여 형성된 저지선 부근의 균사를 비교했을 때 처리군의균사가 무처리군과는 다르게 균사가 정상적인 균사와는 다른 형태인 것을 확인하였다(Fig. 8).
길항균의 식물병 억제 효과
토양에서 분리한 유용미생물과 식물병원성 진균과 대치배양을 통해 확인된 길항성을 식물체에서 검증하기 위해 pot에서 생물검정을 실시하였다. 대상 병원균은 십자화과 식물에 모잘록병과 균핵병을 유발하는 R. solani와 S. minor와 그에 강한 길항성을 나타내는 PA4, PA5 균주를 대상으로 실시하였다. 처리는 병원균 접종 후 길항균을 접종하는 방법과 길항균을 접종 후 병원균을 접종하는 2가지 방법으로 실시하였다. 그 결과 무에서는 모잘록병이 발병하여 유용미생물의 효과를 확인할 수 있었다. R. solani를 접종한 대조구에서는 66.5% 발병한 반면, 무처리 대조구에서는 모잘록병이 발병되지 않았다. 그러므로 R. solani가 효과적으로 접종되었다고 판단되었다. 유용미생물 PA4, PA5를 처리한 것 모두 R. solani 접종 대조구보다 낮은 발병율을보였으며, 모잘록병 방제효과는 PA5가 더 좋은 것을 확인하였다. 또한 병원균 접종 후 길항균을 처리한 것과 먼저 길항균을 처리 후 병을 처리하는 것에 따른 효과는 길항균처리 후 병원균을 처리한 것이 모잘록병 방제에 더 효과적이었다(Fig. 9).
Fig. 9. Inhibitory effect of bacterial isolates PA4 and PA5 on radish against damping off disease caused by Rhizoctonia solani. A,water treated only; B, R. solani inoculated only; C, treated with PA4 and then inoculated R. solani; D, inoculated R. solani and then treated with PA4; E, treated with PA5 and then inoculated R. solani; F, inoculated R. solani and then treated with PA5.
고 찰
본 연구에서 사용된 유용 미생물 중 PA5와 PA12가 식물병원성 진균의 생장억제 효과가 가장 높은 것을 확인하였다. 선발 미생물의 식물병원성 진균의 생장을 억제하는 2차대사산물의 영향으로, 그 중 특히 진균의 세포벽 구성물질인 chitin을 분해하는 chitinase, 다양한 세균 및 곰팡이의 생장을 억제하는 antibiotics 그리고 다양한 효소와 volatile compounds 등 2차 대사산물이 식물병원성 진균의 생장을 억제하는 기작으로 작용하는 것으로 보여진다 [2, 5]. 본 연구에서 사용된 선발 세균의 식물병원성 진균의 작용 메커니즘을 밝히기 위해 volatile compounds의 진균 생장 억제능력 여부를 실험하였지만 본 실험에서 사용된 균주의volatile compounds에 의한 진균 생장 억제 효과는 확인하지 못하였다. 또한 이전 연구에 따르면 Bacillus spp.가 분비하는 chitinase의 영향으로 고추의 뿌리썩음병을 일으키는 Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani을 억제한다는 연구가 보고된 바 있지만[8] 선발 균주에서는 chitinase를 분비하지 않는 것을 확인하였다. 하지만 토양 내 다양한 유기물을 분해할 수 있는 효소 활성을 실험한 결과 5균주 모두 다양한 종류의 효소를 분비하는 것을 확인할 수 있었다. 미생물의 생장 중 다양한 효소의 분비는 토양 내 유기물을 분해하는데 중요한 역할을 하며 유기물 분해는 식물 생장 중 이용할 수 없는 고분자의 물질을 이용 가능한 저분자의 물질로 변화시킨다는데 중요한 의의가 있다. 또한 인산은 토양에서 식물이 이용할 수 없는 난용성 인산으로 쉽게 변화하는데, 선발된 균주 모두에서 난용성 인산을 가용화 시키는 능력이 있음을 확인하였다. 이는 토양에서 인산의 구조를변화시킴으로 식물의 인산 흡수율을 증가시켜 식물의 생육을 건전하게 할 수 있을 것으로 생각된다[9]. 그리고 PA1,PA2, PA4, PA12 균주는 siderophore를 생성하므로 인해 난용성인 Fe(OH)3의 구조를 Fe3+의 이온 형태로 변화시켜 식물이 재흡수할 수 있도록 하며, 근권 주위의 Fe3+의 이온을 식물 및 유용미생물이 흡수함으로 인해 식물병원성 미생물이 생육하는 것을 억제할 수 있을 것으로 추측된다 [10]. 미생물의 hydrogen cyanide (HCN) 분비는 식물 근권의 병원성 미생물의 생장을 억제할 수 있다고 보고되었다[11, 12].본 연구에서 사용된 유용미생물 PA1, PA2, PA12 균주도 이 같은 효과가 있을 것으로 추측된다.
다음 연구에서는 유용미생물들이 2차 대사산물의 정량적 분석과 그것들을 분비하는 유전자에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다. 또한 유용미생물이 식물의 병 저항성 관련유전자의 발현에 미치는 영향과 미생물제제의 제형 연구를 통해 미생물제제의 보존기간을 늘리고 그 효과를 장기간 유지시킬 수 있는 연구가 수행되어야 할 것이다.
적 요
본 연구는 식물 근권에서 분리한 유용미생물 PA1, PA2,PA4, PA5, PA12 의 식물 생장 촉진능력과 식물 병원성 진균인 Colletotrichum acutatum, C. coccodes, C. gloeosporioides,C. dematium, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani,Sclerotinia minor 그리고 Fusarium sp.에 대한 생장억제능력을 평가하는데 그 목적이 있다. In vitro 실험에서 유용미생물의 식물 병원성 진균의 생장억제 능력을 확인하기 위해 세균배지인 TSA 배지와 곰팡이 배지인 PDA배지, 그리고 TSA와 PDA배지를 각각 50%씩 혼합한 배지(v/v, 1:1)에서 대치배양을 실시하였다. 그 결과 PDA배지에서는 PA2가 C. coccodes에 대해 65.5%로 가장 높은 억제능력을 보였으며, TSA배지에서는 PA2가 S. minor에 대해 96.5%로 가장 높은 억제력을 보였다. 또한 PDA와 TSA를 혼합한 배지에서는 PA2가 C. acutatum에 대해 58.5%로 가장 높은 억제 능력을 보였다. 분리한 5균주 모두에서 식물병원성 진균에 대하여 생물적 방제 효과가 있음을 확인하였다. 또한 식물생장 촉진능력을 유발하는 원인물질을 탐색하기 위해 siderophore,protease, chitinase, hydrogen cyanide (HCN) 생성 유무를 확인하였고, phosphate solubilizing 실험을 실시하였다. 본 연구에서 사용된 유용미생물 5균주를 16s rDNA sequencing 결과 PA1, PA2는 Bacillus subtilis, PA4, PA5,PA12 각각 Bacillus altitudinis, PaeniBacillus polymyxa,Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었다.
