단포자 분리 및 교잡계통 육성
표고는 한국, 일본, 중국 등 동아시아 지역에서 주로 재배하여 소비되고 있다. 우리나라는 표고를 매년 3만 톤 이상을 생산하고 있어, 산림 분야의 으뜸 버섯으로 인식하고 있다[1]. 표고의 재배 방법은 크게 원목재배와 톱밥재배가 있는데, 재배 유형에 따라 사용하는 품종도 다르다. 또한 표고는 자실체가 주로 발생하는 온도 범위에 따라 저온성, 중온성, 고온성 품종으로 구분하고 있다. 이로 인해, 표고 품종은 재배 방법과 자실체 발생 온도 범위에 따라 다양하게 개발되고 있다[2, 3]. 최근에는 표고 재배가 연중생산체계로 전환되는 과정에서 재배기간이 짧은 것을 선호하는 경향이 있다.
버섯 품종 개발은 단포자 교잡과 단포자와 이핵균사 교잡을 통해 이루어진다[4]. 단포자 간 교잡은 단포자와 이핵균사 간의 교잡보다 교잡 확인이 빠르다. 본 연구는 단포자 간 교잡방법으로 만들어진 교잡계통을 100일 균사배양을 통해 자실체가 만들어진 균주 선발에 주안점을 두었다. 이 결과는 2018년도 표고 단포자 교잡 계통의 자실체 발생 특성을 조사하는 과정에서 얻어진 것을 보고하고자 한다.
우수 품종 개발을 위해 사용한 교잡 표고 균주는 총 14개로, 국립산림과학원 보관균주를 사용하였다. 보관균주를 톱밥재배 하여 발생시킨 버섯으로부터 단포자를 받아 멸균수로 희석한 후, 이를 PDA (potato dextrose agar) 배지에 도말하였다. 20℃ 배양실에서 5-7일간 배양하면서 발아된 단포자는 50개씩 PDA 배지에 계대배양 하였다. 25℃ 배양실에서 20일간 배양한 후, 균사 생장이 빠르거나 균총 모양이 대부분의 것과 다른(균사 밀도, 균사 가장자리 모양) 단포자 분리주를 10개 또는 20개씩 선택하였다. 선택한 단포자 균주는 현미경 검경(1000배)을 통해 균사체에 꺽쇠 연결체(clamp connection)가 없음을 확인한 후 교잡에 사용하였다.
PDA 배지에서 20일 정도 배양된 2개의 서로 다른 단포자 균주를 대치배양을 실시하였다(Fig. 1).한 쌍의 모본균주 균사체를 0.5~0.7 cm 크기의 사각형 조각으로 절단한 후, PDA 배지 표면 위에 서로 맞닿게 하여 접종하였다. 22~23℃ 배양실에서 20일간 균사체를 배양하면서 육안관찰과 현미경 검경을 통해 교잡이 이루어졌음을 확인하고, 교잡된 부위를 순수분리 및 계대배양 하여 톱밥배지 접종원으로 사용하였다[4].
자실체 발생 및 특성 조사
신갈나무 톱밥과 밀기울을 무게비로 80:20(w/w) 비율로 섞고, 수분 함량은 60% 내외로 조정하였다. 1,000 mL 부피의 종균병에 톱밥배지를 650~700 g씩 넣은 후, 121℃에서 90분간 멸균하였다. 균을 접종한 배지는 22~23℃ 배양실에서 60일 암배양 한 후 40일 명배양 하여 총 100일 배양하였다. 배양이 완료된 배지는 플라스틱 용기를 벗겨낸 후 상대습도 90% 이상, 설정온도 17~18℃에서 자실체 발생을 유도하였다. 버섯 발생은 30일간 지속적으로 관찰하였고, 발생한 버섯은 무게, 크기, 모양 등을 조사하였다. 우량 계통은 정상인 버섯 모양, 갓 두께가 1.5 cm 이상, 생중량 30 g 이상, 모양이 독특한 것 (예: 주름살이 없거나 대가 짧거나, 갓이 큰 것) 등의 품질 기준에 따라 선발하였다.
교잡계통 육성
교잡계통은 14개 균주(2444, 2462, 2471, 2694, 3404, 3420, 3447, 3461, 3909, 4241, 4242, 4243, 4244, 4245) 를 임의로 조합하였고, 단포자를 각각 10개씩 선택하여 100개의 조합을 만들어 총 3,100개의 교잡체를 만들었다. 이중 재배시험용으로 선발한 계통은 1,638개로 총 교잡율은 53%로 나타났다.
버섯 발생 특성 및 우수 계통 선발
1,638개의 교잡을 확인한 계통중에서 버섯이 발생한 계통은 364개, 이들 중 버섯의 모양과 크기를 기준으로 65개 계통을 선발하였다(Table 1; Fig. 2). 일반적으로 표고는 색이 밝고, 갓이 둥글고, 갓이 크고, 탱탱한 것을 선호한다. 이러한 선호기준을 감안하여 버섯이 30 g 이상, 갓 두께가 1.5 cm 이상, 정상의 버섯모양을 갖는 것을 선발하였다. 교잡에 사용한 균주의 반복수가 1회부터 10회까지로 전체적으로 그 특성을 비교하기는 어려웠다. 단지, 10회 조합을 가진 2462 n1-n10과 3420 n1-n10을 기준으로 했을 때, 우량품종 후보 계통으로 선발된 65개 균주 중 5회 이상(임의 기준) 동일 단포자를 갖는 것은 2462n1 (5회), 2462 n2 (6회), 2462 n10 (5회), 3420 n3 (8회)으로 나타났다. 이들 단포자는 우량한 형질을 가진 육성 균주를 만들 확률이 높을 것으로 판단되었다.
Ha 등[5]은 이미 이핵균주 생성에 있어 일부분은 단포자 균주의 영향이 높게 반영된다는 것과 몇몇 단포자 균주는 자실체의 발생과 생산량에 영향을 준다는 것을 보고하였다. 본 결과에서도 일부 단포자 균주가 우량하다고 판단되는 균주에 반복적으로 포함된 것으로 볼 때 품질에 영향을 끼치는 것으로 추정할 수 있었다. 앞으로 이들 균주는 버섯의 모양 또는 생산량에 영향을 주는 유전자를 찾는데 유용한 모균주로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구를 통해 나타난 표고 교잡계통 생성 성공률은 53%로, Ha 등[5]이 교배형을 고려한 타가교잡 성공률 51%와 비슷하였다. 버섯 발생률은 22%(총1,638개 교잡계통 중 364개 균주)로 균사체에서 교잡을 확인하여도 자실체 발생이 되지 않음을 알 수 있었다. 교잡을 확인한 계통 중 품질이 우수한 계통으로 선발된 것은 18%(65개 균주)로 나타났다. 1차 재배시험으로 선발한 우량계통은 앞으로 생산력검정과 농가실증을 통해 생산성과 상업성을 검정하는 과정을 거쳐 품종등록으로 이어져야 한다.
버섯이 발생한 364개의 교잡계통의 형태를 조사한 결과, 갓에 주름이 없는 균주는 40개, 대 모양이 원통형이 균주는 255개, 대 아래쪽이 뭉툭한 균주는 15개, 대 위쪽이 뭉툭한 균주는 94개였다. 특히, 주름살이 없는 40개 균주는 3461 n8, 3420 n3, 2462 n8이 각각 5회 포함되어 35%를 차지하고 있었다. 주름살이 없는 균주는 단포자 조합이 서로 함께 포함되기보다는 서로 다른 조합에서 나타나는 것이 많아 단포자 교잡 상호작용보다는 하나의 단포자가 주름살 유무를 결정하는데 더 크게 관여한다는 것을 알 수 있었다(Table 2). 이와 같은 결과는 추후 분자생물학적 분석으로 확인하는 연구가 필요하다.
|
Table 1. List of 65 superior candidate strains selected based on shape and size of the fruiting body of Lentinula edodes 
|
Fig. 2. Photographs of the fruiting bodies of Lentinula edodes. A, NIFoS strain No 4243; B, 4267; C, 4269; D, 4271; E, 4272; F, 4277; G, 4282’ H, 4286; I, 4294; J, 4307; K, 4317; L, 4318; M, 4320; N, 4336; O, 4345; P, 4348; Q, 4450; R, 4460; S, 4470; T, 4473; U, 4477; V, 4483; W, 4489; X, 4490; Y, 4496; Z, 4503; AA, 4508; AB, 4512; AC, 4518; AD, 4530; AE, 4535; AF, 4544.
적요
표고는 동아시아 지역에서 매우 중요한 식용버섯이다. 표고 우량품종을 개발하기 위해 14개 균주를 사용하였고, 단포자교잡을 통해 3,100개의 조합으로부터 1,638개의 교잡계통을 육성하였다. 교잡계통의 톱밥재배 시험결과 364개 계통의 버섯이 발생하였으며, 버섯의 모양과 크기를 기준으로 65개의 우량 후보계통을 최종 선발하였다. 364개 계통 중 주름이 없는 균주는 40개, 대의 모양이 원통형인 균주는 255개, 대 아래쪽이 뭉툭한 형태는 15개, 대 위쪽이 뭉툭한 형태는 94개로 관찰되었다. 10번의 조합을 가진 2462 n1-n10과 3420 n1-n10을 기준으로 했을 때, 65개의 우량한 후보 계통 중 5회 이상 동일 단포자가 포함된 것은 2462 n1, 2462 n2, 2462 n10, 3420 n3 이었다. 이들 단포자 균주들은 표고의 교잡계통을 만드는데 우수한 균주로 판단된다.
