Microbiological Characteristics and Physiological Functionalities of Unrecorded Wild Yeast Strains in the Soils of Hajodae and Gyungpodae Beaches in Korea

서론

효모는 오래전부터 전통발효식품 제조에 이용되어 왔고[1] 근래에는 여러가지 생리활성 물질 생산 균주[2]와 분자생물학 연구에서 숙주 균주로도 폭넓게 이용되고 있다. 이와 같이 근래에 산업적 응용성이 커지고 있는 효모를 다양하게 발굴하여 확보하고자, 최근 필자 등은 한라산, 덕유산등의 우리나라 주요 산들과 제주도, 울릉도 등의 섬 및 도시와 농촌 등지의 야생화들과 토양 및 각종 부식물 등으로부터 약 1,800여종의 야생효모들을 분리하여 동정하여 보고하였다[3-18].

또한, 이들 중 비병원성 효모들의 경우 건강소재 개발을 위한 생리활성 우수 효모들을 선발하여 보고하였고[4,8,9,18,19], 아직까지 국내에서 보고되지 않은 미기록 야생효모들은 선별한 후 이들의 미생물학적 특징들을 보고하였다[10,12,14,15,17]. 지금까지의 연구를 통하여, 자연계에 분포하고 있는 야생효모들은 지역간의 기후 특성에 따른 야생화와 토양, 부식물 등의 분리원에 따라 독특한 효모 종 다양성이 있었고, 같은 분리원이라도 공원이나 주택지와 공단지역, 산림지, 논, 밭 등 분리원의 채취 장소에 따라 야생효모들이 다양하게 분포하고 있었다. 또한 같은 지역이라도 재배 식물에 따라 토양에 분포하는 야생효모 종 특성이 달라서 인삼 재배지 토양에서는 Rhodotonular glutinis가 가장 많이 분리되었고 당귀밭에서는 Cyberlindnera satumus 야생효모가 주로 분리, 동정되었다[18].

본 연구는 우리나라 동해안 해수욕장 주변 토양들의 야생효모 종 다양성을 확립하고 이들 중 아직까지 국내에 보고되지 않은 미기록 야생효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성을 밝히고 나아가 건강소재를 생산하는 산업적 우수효모들을 선발할 목적으로 실시되었다.이를 위해 해마다 많은 사람들이 이용하는 하조대와 경포대 해수욕장과 경포호수 주변 토양들로부터 야생효모들을 분리하여 동정하였고 이들 야생효모들 중 국내에 보고되지 않은 미기록 야생효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성을 조사하였다. 또한 이들의 무세포추출물들을 제조한 후, 항치매성 acetylcholine esterase 저해활성, butyrylcholine esterase 저해활성 및 미백성 tyrosinase 저해활성 등을 측정하였다.

재료 및 방법

야생효모의 분리 및 동정

강원도 동해안의 하조대 해수욕장(38°01'25.8"N, 128°43'27.2"E) 주변 토양 30점과 경포대 해수욕장(37°48'21.8"N, 128°54'29.9"E)과 경포 호수(37°47'55.1"N, 128°54'37.5"E) 주변 토양 45점들을 2018년 7월에 무균적으로 채취하여 멸균 튜브에 넣고, 5 mL의 멸균수를 첨가한 후 2시간 동안 진탕하였다. 이들 현탁액 일부를 스트렙토마이신(100 μg/mL)과 앰피실린(100 μg/mL)이 들어 있는 YPD(yeast extract-peptone-dextrose) 한천배지에 도말하고 30℃ 에서 48시간 배양한 후 형성된 효모 집락들을 분리하였다[13].

분리효모들의 동정을 위하여 먼저 이들의 26S rDNA의D1/D2 부위의 염기서열들을 결정한 후, 이들 염기서열들을 미국 국립생물정보센터(NCBI, http://ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST를 사용하여 데이터베이스에 등록되어 있는 효모들과의 상동성을 비교하여 분자생물학적 유연관계를 분석하여 동정하였다[11-13].

국내 미기록 효모들의 선별 및 균학적 특성

위와 같이 하조대와 경포대 해수욕장 주변 토양 시료들에서 분리, 동정한 126종의 야생효모들을 대상으로 국립 생물자원관(NIBR, the National Institute of Biological Resources) DB와 한국 진균관련 학술자료들을 이용하여 국내 미기록 효모들을 선별한 후 일반 미생물 실험방법 등을 이용하여 이들의 몇 가지 균학적 특성 등을 조사하였다[10,12].

국내 미기록 야생효모들의 acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase 저해활성과 tyrosinase 저해활성 측정

위와 같이 선발된 국내 미기록 야생효모들을 YPD배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 8,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 세포배양물을 얻었다.

세포 배양물은 다시 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.3)에 현탁시킨 후 초음파 균체파쇄기(Vibra cell; SONICS & Materials, Newtown, USA)로 파쇄하고 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 무세포추출물을 얻었다. 무세포추출물들을 동결건조시킨 후 이들을 0.1 M Sodium phosphate 완충용액(pH 7.3)에 10 mg/mL로 용해시켜 생리활성 측정용 시료로 사용하였다[9].

먼저 항치매성 Acetylcholinesterase (AChE) 저해활성은 각 well plate에 0.1 M sodium 인산완충용액 (pH 7.3) 110 μL, acetylcholinesterase (0.8 unit/ml) 30 μL, 기질 (2 mM acetylthiocholine chloride) 30 μL, 2 mM DTNB 20 μL, assay buffer에 1 mg/ml로 용해시킨 sample 10 μL들을 혼합하여 37℃에서 6분 동안 반응시킨 후 A VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 415 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래와 같이 AChE저해활성을 계산하였다[8, 19].

Butyrylcholinesterase (BChE) 저해활성은 무세포추출물 50 μL에 0.1M 인산완충(pH 7.3) 70 μL, BChE (0.8unit/ml) 30 μL, DTNB (2mM) 20 μL 들을 혼합한 후 2mM acetylcholine chloride 30 μL을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 다음, 415nm에서 흡광도를 측정하여 위와 같은 AChE저해활성 측정식으로 BChE저해활성을 계산하였다.

미백성 Tyrosinase 저해활성은 무세포추출물 시료 25 μL에 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8) 150 μL, 1.5 mM L-tyrosinase 50 μL 혼합 후 37℃에서 ELISA reader를 이용하여 5분간 incubation한 후 tyrosinase 40 U을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 470 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래와 같은 식으로 tyrosinase 저해활성을 계산하였다[18, 20].

Tyrosinase 저해활성(%) = [{C − (T − B) }/C] ⅹ 100 (C, 대조구의 흡광도 T, 시료구의 흡광도 B, 시료구 blank의 흡광도)

결과 및 고찰

하조대와 경포대 해수욕장, 경포호수 주변 토양들로부터 야생효모의 분리 및 동정

강원도 동해안 북부 속초 부근에 위치한 하조대 해수욕장 주변 토양 30점에서 야생효모들을 분리, 동정한 결과, Table 1과 같이 모두 18속, 22종, 27균주의 다양한 야생효모들을 분리, 동정하였다. 이들 중 Metschnikowia 속 균과 Candida 속 균 등이 많이 분리, 동정되었고 5탄당 자화균주로 알려진 Trichosporon moniliforme 균주도 3균주 분리되었다. 또한, 강릉에 위치한 경포대 해수욕장과 경포호수 주변 토양 45점에서는 Aureobasidium melanogenum JR 3-13을 포함하는 39종 55균주의 야생 효모들이 분리, 동정되었다(Table 2). 이와 같이 하조대와 경포대 해수욕장 주변 토양(75점)에서 각각 27균주와 56균주의 야생효모들이 분리된 것은, 민 등(5)이 동해안의 동해시와 서해안의 대천 해수욕장, 남해안의 완도 대문리 등지의 야생화 시료들에서 각각 27균주, 34균주, 22균주의 야생효모들 총 54점을 분리, 동정하였던 결과 보고와 같이 해안지역들과 야생화, 토양 등의 시료들간에 독특한 효모 종 다양성을 보이는 것으로 사료된다. 또한 이들 결과들은 전보[3,4,7,9,11-14]의 내륙지역 야생화와 토양들에서 분리된 야생 효모들보다는 좀 더 다양한 효모 속과 종 분포특성을 보였다.

하조대와 경포대 해수욕장에서 분리, 선별한 국내 미기록 야생효모들의 균학적 특성

하조대와 경포대 해수욕장, 경포호수로부터 분리한 야생효모들중 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1 (NIBRFGC000502620, Genebank MN339674), Dothichiza pithyophila HJ22-4 (NIBRFGC000502621, Genebank MN339673), Metschnikowia bicuspidata HJ16-1 (NIBRFGC000502622, Genebank MN339681), Sakaguchia cladiensis HJ14-1 (NIBRFGC000502623, Genebank MN339680), Aureobasidium melanogenum JR3-1 (NIBRFGC000502624, Genebank MN339678), Diutina siamensis JR37-5 (NIBRFGC000502625, Genebank MN339676), Metschnikowia colchici JR2-2 (NIBRFGC000502626, Genebank MN339679), Pseudozyma pruni JR13-2 (NIBRFGC000502627, Genebank MN339677), Sporophora toruliformis JR24-1 (NIBRFGC000502628, Genebank MN339675)와 Candida gelsemii DC35-1 (NIBRFGC000502629, Genebank MN339672) 등 모두 10균주들이 국내 미기록 효모들로 최종 선별되었다. 이들의 균학적 특성과 계통수는 Table 3, Fig. 1, Fig. 2와 같다.

이들 미기록 효모들의 형태적, 배양적 특징으로 먼저 Metschnikowia bicuspidata HJ16-1외에는 모두 구형으로 출아에 의해 영양증식을 하였고 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1, Metschnikowia bicuspidata HJ16-1, Sakaguchia cladiensis HJ14-1, Aureobasidium melanogenum JR3-1, Metschnikowia colchici JR2-2, Pseudozyma pruni JR13-2과 Sporophora toruliformis JR24-1들은 자낭포자를 형성하였다.

또한, Aureobasidium melanogenum JR3-1, Metschnikowia colchici JR2-2, Pseudozyma pruni JR13-2와 Sporophora toruliformis JR24-1등은 vitamin을 함유하지 않은 YPD배지에서도 생육하였고 특히 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1 외에 9균주 모두 20% 포도당을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 내당성 효모들로서 이들은 알코올 발효산업에서 고농도 담금에 유용할 것이고 내당성(삼투성) 효소생산 등에도 매우 유용할 것으로 사료된다.

항치매활성과 미백활성을 가진 건강 소재를 생성하는 야생효모들을 선별하기 위하여 미기록 야생효모들의 무세포 추출물에 대한 항치매성 actylcholinesterase 와 butyrylcholinesterase 저해활성과 미백성 tyrosinase 저해활성들을 측정하였다(Table 4). 10주의 국내 미기록 야생효모들의 무세포추출물들중 Diutina siamensis JR37-5 균주가 30.9%의 가장 높은 tyrosinase 저해활성을 보였고 Aureobasidium melanogenum JR 3-1 균주도 20.3%의 tyrosinase저해활성을 보였으나 항치매성 actylcholinesterase 와 butyrylcholinesterase 저해활성은 대부분의 무세포 추출물들이 없거나 5%미만을 보였다. Diutina siamensis JR37-5의 30.9% tyrosinase 저해활성은 김 등[18]의 인삼밭 토양에서 분리한 야생효모 Naganishia globosa G1-7의 28%와 한 등[21]의 Starmerella bombicola 80-J-1의 저해활성(36.2%)과 비슷하거나 약간 낮은 저해활성이었다. 또한 tyrosinase 저해활성이 가장 높았던 Diutina siamensis JR37-5균주는 Khunnamwong 등[22]이 태국의 벼 잎 조직에서 처음 분리, 동정하여 보고되었을 뿐 이들의 산업적 응용 연구는 본 연구가 처음이다. 따라서 이 야생효모 균주는 앞으로 미백 기능성 소재 생산에 매우 유용할 것으로 사료되고 tyrosinase 저해물질 생산조건의 최적화와 물질 특성 규명 등의 추가 연구가 요구된다.

적요

우리나라 강원도 동해안 해수욕장 주변 토양의 야생효모들의 종 분포특성을 알아보고자 하조대와 경포대 해수욕장, 경포호수 주변 토양들로부터 야생효모들을 분리, 동정하였고, 이들 중 국내 미기록 효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성과 생리활성 등을 조사하였다. 하조대 해수욕장 주변 토양 30점 시료들로부터 22종, 27균주의 야생효모들을 분리, 동정하였고 경포대 해수욕장과 경포호수 주변 토양 45점에서 Aureobasidium melanogenum JR 3-13을 포함하는 39종 55균주의 야생효모들을 분리하였다. 이들 두 해수욕장에서 분리한 야생효모들 중 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1, Dothichiza pithyophila HJ22-4, Metschnikowia bicuspidata HJ16-1, Sakaguchia cladiensis HJ14-1, Aureobasidium melanogenum JR3-1, Diutina siamensis JR37-5, Metschnikowia colchici JR2-2, Pseudozyma pruni JR13-2, Sporophora toruliformis JR24-1과 Candida gelsemii DC35-1등 10균주들이 국내 미기록 효모들로 최종 선별되었다. 이들은 대부분 구형으로 출아법으로 영양증식을 하였고 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1, Metschnikowia bicuspidata HJ16-1, Sakaguchia cladiensis HJ14-1, Aureobasidium melanogenum JR3-1, Metschnikowia colchici JR2-2, Pseudozyma pruni JR13-2 과 Sporophora toruliformis JR24-1등은 자낭포자를 형성하였다. Aureobasidium melanogenum JR3-1 등 4종의 미기록 효모들은 vitamin을 함유하지 않은 YPD 배지에서도 생육하였고 Cyberlindnera culbertsonii HJ31-1외에 9균주들이 20% 포도당을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 내당성 효모들이었다. 이들 국내 미기록 야생효모들의 무세포추출물들중 Diutina siamensis JR37-5균주가 30.9%의 가장 높은 tyrosinase 저해활성을 나타내었고 Aureobasidium melanogenum JR3-1 균주도 20.3%의 tyrosinase 저해활성을 보였다.

ACKNOWLEDGEMENTS

This research was supported by the project on the survey and excavation of Korean indigenous species of the National Institute of Biological Resources (NIBR 201902113) under the Ministry of Environment, Republic of Korea.