서론
느티만가닥버섯은 담자균류(Basidiomycota), 주름버섯목(Agaricales), 만가닥버섯과(Lyophyllaceae)에 속하는 식용버섯으로 영문명은 Beech mushroom이고 일본명은 Bunashimeji（ブナシメジ）로 불리고 있다. 현재 상업적으로 인공재배 되고 있는 만가닥버섯류는 Hypsizygus ulmarius (Bull.) Redhead와 Hypsizygus marmoreus (Peck) H.E. Bigelow 2종류이다. 일본에서 재배되고 있는 H. ulmarius와 H. marmoreus[1]는 형태학적 특성이 매우 유사하여 종 분류에 어려움이 많아 Nagasawa와 Arita[2]는 정확한 분류를 위하여 H. marmoreus와 H. ulmarius를 포자의 크기와 형태, 갓의 색과 반점 유무, 균사와 자실체의 형태적 특징을 비교하여 재분류한 바 있다.
Hypsizygus marmoreus는 포자는 4-6.4 × 3.6-4.8 ㎛의 비교적 작은 크기로 5 ㎛ 이하의 구형이거나 반구형이고, 갓에는 진한 색의 반점이 중앙 혹은 전면에 형성되며, 자실체는 밀생하는 특성이 있다. 균사는 분절, 후막포자를 형성한 반면에 H. ulmarius는 5 ㎛ 이상의 포자 크기(5-6.5 × 4-5 ㎛)에 반구형에 보통은 타원형의 포자를 형성하고, 갓에 반점이 없거나 불분명하고 미세인편상을 형성한다. 주로 단생하고 균사는 무성포자 형성을 하지 않는 것으로 보고된 바 있다[2,3].
전통적인 버섯의 분류는 자실체의 형태적 특성을 이용하였는데, 형태적 특징은 환경적 요인에 따라 달라질 수 있고 재배하여 확인하기에는 시간이 오래 소요되는 등 제약이 있다. DNA 검정법은 환경적 영향을 배제할 수 있으며, 적은 미생물 밀도에서 검출이 가능한 고도의 민감성과 신속성, 정확성 및 단순성을 특징으로 한다. Polymerase chain reaction (PCR) 기법으로 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) [4], Arbitrary Primer (AP)-PCR [5]과 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) [6] 등이 널리 적용 되어왔다. 느티만가닥버섯에 대한 RAPD 분석은 Lim [7] 등이 수집한 30균주에 대하여 OPS-1, OPS-10, OPL-13 primer를 이용하여 기원이 동일시되는 그룹과 국내 야생종을 구분하는 PCR다형성을 검출 하였다. 한편 균류의 PCR 핵산지문 분석에 광범위하게 이용 가능한 20-mer의 염기로 구성된 URP (Universal Rice Primer) [8]가 균류의 종간, 종내 PCR다형성검출에 유용하게 이용되어 왔다. URP-PCR은 Pleurotus spp. [9-13] 과 Phellinus spp. [14] 등 담자균류의 종내 품종, 계통의 유전적 분류에 이용했으며, 자낭균인 Paecilomyces japonica 와 Cordyceps militaris [15] 의 유전적 다양성 검정 등 다양한 균류에 유용하게 적용 할 수 있었다.
최근 국내에서도 인공 재배되어 시장을 확장하고 있는 만가닥버섯류의 분류학적 위치를 재정립하기 위하여 국내외에서 109 균주와 국내에 판매되고 있는 2 균주를 포함하여 111 균주를 수집하였고, 인공재배를 통하여 자실체를 형성시켜 형태적 특징 등을 조사하였다. Redhead [16,17] 와 Nagasawa 등[2]이 보고한 형태적 특징을 기초로 하여 외형적 특징인 갓의 색과 형태, 반점 무늬 유무를 확인하고, 현미경적 특징으로 균사의 꺽쇠연결, 분절포자 및 후막포자 형성, 담자포자의 크기 등을 조사하였는데, 몇몇 균주를 제외하고 분절포자와 후막포자의 형성을 확인할 수 있었다. 미세구조 상으로 확실한 종내 분류가 이루어지지 않아 다음 실험으로 종간, 종내 분류에 많이 사용되고 있는 URP-PCR과 ITS (Internal transcribed spacer) rDNA분석을 하여 수집된 균주 간의 형태적 특성 및 유전적 유연관계를 비교 분석하였다.
재료 및 방법
공시균주
느티만가닥버섯 유전자원은 국내외 균주 보존기관에서 분양받거나, 시판버섯과 국내에서 자생하는 버섯에서 조직분리법으로 분리하여 확보하였다. 이 중 한국농수산대학 보유 균주가 19균주이며, 농촌진흥청 농업과학원에서 44균주, 인천대학교에서 48균주를 각각 분양 받았다(Table 1). 이들 균주의 수집 지역별 분포는 한국 자생균주 5균주, 중국 도입균주 35균주, 대만도입균주 13균주이고 나머지는 명확하지 않으나 일본에서 수집된 것으로 추정된다.
공시균주는 20% Glycerol용액에 침지하여 -70℃에 보관하였으며 PDA (Potato dextrose agar) 배지에 계대 배양하여 5℃에서 보관하면서 실험에 이용하였다.
DNA 분리
공시한 느티만가닥버섯류 균주를 50 mL의 potato dextrose broth (이하 PD broth)에 접종하여 25.0±1.0℃에서 7일간 정치 배양시켰다. 배양된 균사체는 nylon mesh (pore size 50 ㎛)를 이용하여 세척하고, 동결건조하여 마쇄하였다. 마쇄된 균사체 100 ㎎에 400 μL의 extraction buffer [200mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 30 mM EDTA, 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS)]에 현탁하여 50 ㎍의 proteinase K 을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 여기에 400 μL의 2×CTAB solution [2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1% PVP (polyvininylpyrrolidone) (Mr 40,000)]을 첨가하여 섞은 뒤, chloroform : isoamylalcohol (24:1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7 vol.의 isopropanol을 첨가하여 DNA pellet을 얻었다. TE buffer [Tris-HCl(pH 8.0) 10 mM, EDTA(pH 8.0) 1 mM]에 DNA pellet을 녹이고 RNase를 첨가한 뒤 정량하여 4℃에 보관하였다.
URP-PCR 핵산지문 및 ITS 염기서열 분석
URP-PCR은 11종의 URP primer 중에서 증폭생성물이 가장 확연하게 보인 URP1F, URP2F 2종을 사용하였다. PCR은 15 ng genomic DNA, primer 200 nM, dNTP's 125 μM, Taq DNA polymerase 0.5 unit, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2에 H2O를 첨가하여 최종 volume을 20 ㎕로 조정하였다. DNA의 증폭에 사용된 PCR 증폭기는 Mycycler™ Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 사용하였고, DNA 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 3분간 실시하고, denaturation 1분 (94℃), annealing 1분 (55℃), extension 3분 (72℃)으로 40 cycle을 실시한 뒤 72℃에서 7분간 incubation하였다. PCR 반응 후, 15 μL의 생성물을 1.2% agarose gel에서 80 V, 3시간동안 전기영동하고 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.
각 균주의 증폭 산물의 pattern의 비교는 동일한 크기의 band 존재 여부에 따라 0과 1로 나열하여 유사도 (similarity cofficient)를 구하고, unweighted pair group methods with arithmatic average (UPGMA)에 의한 집괴분석을 실시하였다, 유사도와 UPGMA 분석은 NTSYSpc (ver. 2.1, www.winzip.com)를 이용하였다.
URP PCR fingerprint 와 UPGMA 결과, 형태적 특징을 종합하여 분류하였고, 각 그룹 중 표본 균주를 선발하여 ITS 영역에 대한 염기서열 분석을 위하여 ITS1 primer (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 와 LR3 primer (5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3′)를 이용하여 ITS1 영역과 28S (D1/D2 region) 영역에 대한 증폭산물의 염기서열을 의뢰하여 분석하였다. 분석한 염기서열은 Bioedit clustalW와 Mega (ver. 5)프로그램[18]을 이용하여 정렬하고 Kimura2-parameter model을 적용한 neighbor-joining method로 계통수를 작성하였다.
결과 및 고찰
PCR 다형성분석에 의한 유연관계
공시 균주에 대한 예비 실험으로 증폭반응을 확인하고, 가장 확실한 증폭 band를 형성한 URP 1F와 URP 2F primer 2종을 본 실험에 사용하였다.
URP 1F primer 에서는 1.0 kb와 1.3 kb에서 대부분 확실한 증폭 band를 보였고, 대부분 유사한 pattern으로 증폭되었다. URP 2F primer 에서도 1.0 kb 에 확실한 증폭 band를 보였고, 대부분 유사한 pattern으로 증폭되었다. 몇몇 균주들의 증폭이 2종의 primer에서 약간 다른 경향을 보였지만, 주된 증폭 band는 나타나기 때문에 큰 차이는 없는 것으로 보인다.
2종의 primer에 의해 생성된 band를 종합하여 UPGMA에 의한 분석을 한 결과는 Fig. 1과 같다.
대부분의 공시균주는 96-97%의 높은 유사도를 보였으나, 균사에 분절포자와 후막포자가 관찰되지 않았고, 인공재배에서도 자실체를 형성치 못한 HYM-004 균주는 가장 확연하게 다른 증폭 pattern을 보였다. 유사도에서도 84%로 유전적으로는 근연관계에 있다고 할 수 있으나, 같은 종인지는 확신할 수 없었다. 또한 국내 수집균주인 HYM-109와 HYM-110균주는 89% 정도의 유사도로 일본, 중국, 대만에서 수집된 균주들과는 구별되었다.
또한 URP-PCR 분석 결과 백색과 갈색 자실체가 유전적으로 구분되지 않았지만, 인공재배에서 자실체의 형태적 차이가 컸던 HYM-031 와 HYM-047 균주도 90% 이상의 유사도를2020-11-02 보였고, 국내 야생균주는 일본 균주 등과 구분이 되었다. 이는 이 등[19]이 OPS-1, OPS-10과 OPS-13 primer를 이용한 RAPD 분석에서 야생균주와 재배균주의 구분이 가능하였고, 자실체의 형태에서도 차이를 보였다고 보고한 결과와 유사한 결과이며, 외국도입 균주의 유사도가 높고 하나의 cluster를 보이는 것은 외국에서 도입된 재배품종은 1~2균주를 모균주로 육종한 결과를 반영한 것으로 판단된다.
ITS rDNA 분석
URP primer를 이용한 RAPD-PCR fingerprinting과 UPGMA 결과를 기초로 각 group에서 16 균주를 선발하여 ITS 및 28S rDNA 영역에 대한 염기서열 분석을 하였다. ITS 영역은 대부분 종간에 염기서열이 많은 차이가 있지만, 종내에서는 그 차이가 극히 낮아지기 때문에 대부분의 종간 계통학적 유연관계 해석에 이용되고 있다 [20]. 안정적으로 염기서열 분석을 위하여 28S rDNA(D1/D2) 영역을 증폭하여 1,250 bp 정도의 염기서열을 확보하였다.
공시한 균주의 동정 및 분류를 위해서 대조구로 GenBank에서 제공되는 Lyophyllum shimeji HM572522, L. semitale HM572552, H. ulmarius FR686561와 H. marmoreus JN234835균주의 염기서열을 이용하여 정렬하였다.
Table 2와 같이 공시한 16균주 간의 상동성은 93.8-99.1%를 보였으며, L. shimeji HM572522와는 79.0-82.5%, H. ulmarius FR686561는 89.3-94.5%, H. marmoreus JN234835와는 94.8∼99.1%로 높은 상동성을 보였다. 대조구로 사용한 H. marmoreus JN234835는 L. shimeji HM572522와의 상동성이 81.4%로 호가연한 차이를 보였고, 형태적 특성이 유사하여 혼란되었던 H. ulmarius와는 95.4%로 유전적으로도 매우 가까운 유연관계를 형성하고 있다. 이러한 결과로 공시한 16균주는 H. ulmarius보다는 높은 상동성을 보인 H. marmoreus에 가장 가까운 유연관계를 가지는 것으로 확인되었다.
후막포자와 분절포자가 없는 균사와 UPR-PCR에서도 outgroup으로 분류되었던 HYM-004균주의 ITS 염기서열분석 결과, 비교 대상인 L. shimeji와는 81.3%, L. semitale과는 86.3%, H. ulmarius는 93.4%이었고, H. marmoreus는 96.7%의 상동성을 보였다. H. marmoreus와는 염기서열상으로도 ITS1영역에서만 몇 개의 염기 차이를 보일 뿐 큰 차이는 없었다. 다른 공시 균주와의 상동성도 93.8-97.5%으로 H. marmoreus에 가깝다고 판단된다.
Table 2. Similarity matrix based on aligned sequences of ITS1-28S rDNA region for Hypsizygus marmoreus strains and related isolates.
|
형태적 특징과 분자유전학적 특징의 상관관계
인공 재배한 느티만가닥버섯 자실체의 가장 큰 형태적 차이는 갓의 색이 갈색, 백색과 회갈색으로 나뉘고, 회갈색의 갓에는 대리석 반점이 없거나 희미한 것이 특징이었다 (Fig. 2). 담자포자는 미성숙 포자를 제외하고 평균 5 ㎛ 이하의 원형에 가까운 형태를 가졌다. 또한 갓 표면이 인편상이고, 색은 회갈색, 반점이 없거나 희미한 특징을 보여 H. ulmarius로 판단되었던 균주 HYM-031, HYM-047, HYM-109에서도 현미경적 특성 차이가 없이 분절포자 및 후막포자가 관찰되었다. 자실체의 갓 조직은 구형세포가 뭉쳐져 있는 배열이었고, 주름살 조직은 선형구조로 배열되였다. 담자기는 4개의 담자소병을 가지며 낭상체보다는 크게 형성되었고, 낭상체는 곤봉형으로 관찰되었다. 또한 같은 지역에서 수집되었음에도 인공재배에서 형태적으로 다른 특징들을 보이는 것은 유전적 다양성이 있는 것으로 판단하였지만, 갈색자실체와 백색자실체의 형태적 특징은 갓색을 제외하고 큰 차이는 없었다. 자실체의 갓 색을 제외한 형태적 특징이나 현미경적 구조상에서 종내 분류가 가능할 정도의 차이는 발견되지 않았다.
더 확실한 종간 분류를 위해서 URP-PCR 분석에서 선발한 16균주로 ITS 영역의 rDNA 염기서열 분석을 하여 ITS1부터 28S rDNA 영역을 H. marmoreus JN234835등 과 비교 분석한 결과 91.2-97.9%의 상동성이 확인되었었고, H. ulmarius가 형태적, 유전적으로도 매우 유사함이 확인되었다.
공시 균주는 염기서열 정렬 후, Kimura 2 parameter를 사용한 neighbor-Joining method를 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다(Fig. 3). 그 결과, 공시한 균주들간의 유전적으로 매우 가까운 유연관계를 형성하지만, 자실체 갓의 색택이나 반점의 유무, 지역적 특성이 나타나지 않아 유전적 다양성은 없는 것으로 판단된다.
자실체의 형태적인 차이에 의해 H. ulmarius로 판단했던 HYM-031과 HYM-047 균주는 현미경적 특징과 ITS 염기서열분석 등 결과를 종합해 볼 때, 품종 육성의 과정에서 형태적으로 변이가 생긴 것으로 판단된다. 또한 HYM-004 균주는 인공재배에서의 자실체 미형성으로 균주가 퇴화됐거나 환경조건의 부적절했다고 판단하였고, 균사의 현미경적 특성과 URP-PCR 결과 outgroup으로 분류되어 정체가 모호했으나, ITS 영역의 염기서열 분석으로 HYM-004균주는 H. marmoreus 에 속하는 것으로 확인되어, 균주에 변이나 퇴화 발생으로 균사에서 분절 및 후막포자 형성 뿐만아니라 자실체 형성능도 상실된 것으로 판단된다.
본 연구에 공시하고 인공재배에 사용된 균주들은 자실체의 형태적 특징 및 URP-PCR, ITS 영역 분석 등을 종합하여 볼 때, 모두 H. marmoreus 에 속하며, 수집지역에 상관없이 거의 유사한 특성을 보여 1-2균주의 모균주에서 육성되어 재배되고 있는 것으로 판단되며, URP-PCR 분석에서 다른 그룹으로 분류된 국내 야생종은 새로운 품종의 육성을 위하여 사용 가능할 것으로 판단된다.
적요
Hypsizygus marmoreus의 형태적 특성과 유전적 유연관계를 조사하기 위해 한국 및 다른 국가에서 111개의 균주를 수집하였다. RAPD (Random amplified polymorphic DNA) 및 ITS rDNA 염기서열 분석을 이용하여 H. marmoreus 균주간의 유전적 관계를 확인하였다. URP-PCR을 이용한 RAPD 분석 결과, H. marmoreus의 모든 균주는 크게 3개의 그룹으로 분류되었으나, 90% 이상의 높은 유사성을 보였다. 또한 형태적 및 지리적으로 분류가 가능하였으나 갈색 균주 및 흰색 균주는 구별되지 않았다. 따라서 형태적, 지리적 차이가 있는 16개의 균주를 선별하여, 640 bp 길이의 ITS 염기서열을 정렬하고 비교하였다. ITS 염기서열의 유사성은 공시균주와 GenBank의 H. marmoreus 균주 사이에서 94.8-99.1 %였다. 수집지역과 형태에 차이가 있었지만, 실험에 사용된 공시균주는 모두 H. marmoreus에 가까운 유연관계를 형성하였다.
