Genetic Diversity of Agaricus bisporus Strains by PCR Polymorphism

공시품종 및 배양

본 시험에 사용된 양송이 균주는 Table 1과 같이 국내외에서 수집한 A. bisporus 계통 45균주와 Agaricus속의 A. abruptibulbus, A. arvensis, A. augustus, A. bisporus var. avellaneus, A. bitorquis, A. fiardii, A. marginell, A. placomyces, A. potobella, A. rodmanii, A. silvicola, A. subpero-natus, A. subrutilescens 등 총 64균주를 농촌진흥청 원예특작과학원 인삼특작부 버섯과로부터 분양 받아 공시하였다.

Table 1. List of Agaricus strains used in this study and their PCR polymorphic groups

*ASI: Agricultural Science Institute. Acronym for mushroom strains used in Mushroom Science Div. in RDA.

Table 1. Continued

양송이배지는 퇴비추출물(양송이퇴비 40 g/L)에 PDA (po- tato dextrose agar)를 첨가하여 사용하였으며 25ºC에서 15일간 배양하였다.

Genomic DNA추출

Genomic DNA를 분리하기 위하여 Petri dish내 퇴비추출물배지에 셀로판필름을 깔고 직경 5 mm 균사절편을 중간에 접종하여 배양 25일 후에 셀로판필름 위에 형성된 균사체를 수집하여 동결 건조한 균사체를 이쑤시개로 곱게 마쇄하였다. 200μ g의 균사체를 1.5 ml의 에펜도르프 튜브에 옮기고 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5% SDS) 400μ l와 Proteinase K (20 mg/ml)를 첨가하여 유리봉으로 buffer상에서 잘 섞어준 다음 37ºC에서 1시간 동안 유지하였다. 이 혼합액에 2 X CTAB buffer를 동량으로 첨가하여 65ºC에서 15분간 방치하고 ch-loroform:isoamylalcohol (24:1)을 넣고 철저히 혼합한 후 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 0.7 volume의 isopropanol을 첨가하고 실온에서 10분간 방치 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA를 침전하였다. 70%의 ethanol로 DNA침전물을 세척하여 진공 건조한 후 TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100μ l에 용해하였다. 10 mg/ml RNase 2μ l를 넣어 37ºC에서 30분 처리하여 용액 속에 함유된 RNA를 제거하였다. DNA함량을 측정하기 위하여 DNA를 100배로 희석하여 spectrophotometer의 260 nm의 파장에서 실시하였다.

PCR 다형성분석

PCR 다형성 분석을 위하여 URP primer를 곰팡이종 분석에 적용하기 위하여 변형한 12종류의 universal fungal fingerprinting PCR (UFFP) primer (JK Biotech. Co. Ltd)를 사용하였다(Table 2).

Table 2. PCR primers used in this study

ND: Not detected.

PCR반응 용액은 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin, 100 ng prime, 50 ng template DNA, 200μ m dNTP(dCTP, dTTP, dATP, dGTP) 및 2.5 unit Taq polymerase (JK Bio-tech Ltd.)를 넣고 전체 반응용액이 50μ l가 되게 하였다. PCR기기(Takara)를 이용하여 DNA변성을 위하여 94ºC에서 5분간, 그 후 cycle에서 DNA변성은 94ºC에서 1분, an-nealing은 55ºC에서 1분 및 DNA합성은 72ºC에서 2분으로 총 36 cycle을 실시하였으며, 최종 DNA합성은 7분으로 하였다. 증폭된 PCR산물은 1.8%의 garose gel에서 전기영동 한 후 Ethidium bromide 용액에 염색하여 UV lamp 하에서 PCR 다형성밴드를 관찰하였다.

유전적유연관계 분석

양송이(A. bisporus) 계통에서 검출된 PCR 다형성밴드를 유무로 하여 database한 후 유사도(similarity coefficient)를 산출하고, Dendrogram은 위의 유사도의 값을 근거로 UPGA (unweighted paired group methods with arithmatic average)법을 이용하여 작성하였다. 유연관계분석을 위한 program은 NTSYS (numerical taxonomy system using multivariate statiscal programs Ver. 2.2)를 이용하였다.

양송이계통을 포함한 Agaricus spp.의 PCR 다형성 분석

본 연구에서는 국내외에서 수집한 A. bisporus 45계통과 Agaricus spp. 19균주를 포함한 총 64 균주의 genomic DNA를 추출하고 UFPF primer (JK Biotech., Ltd.)를 사용하여 PCR 다형성 분석을 실시하였다. 12종류의 UFPF primer를 사용하여 양송이 균주를 분석한 결과, UFPF1, UFPF2, UFPF3, UFPF7, UFPF9, UFPF10, UFPF11, UFPF 12가 2개에서 9개의 PCR 다형성 밴드가 증폭되어 양송이계통 간의 PCR 다형성 검출에 적용할 수 있는 것으로 판단되었다(Table 2). UFPF primer중에서 URPF1와 UFPF3, UFPF7, UFPF11 primer는 A. bisporus의 종내 계통간 다양한 PCR다형성밴드를 검출하여 매우 유용한 primer로 사료되었다. UFPF1, UFPF2, UFPF3, UFPF7, UFPF11에의하여 검출된 양송이 종내 종간 64균주의 PCR 다형성밴드를 관찰한 결과는 Fig. 1과 같다.

Fig. 1 PCR polymorphisms of 45 Agaricus bisporus strains and 19 strains of other Agaricus spp. amplified by primers UFPF1(A), UFPF2(B), UFPF3(C), UFPF7(D) and UFPF11(E). Each number on lanes is identical to that of Table 1.

A. bisporus계통 45균주에는 국내에서 2010년에서 2012년 사이에 개발된 새아(ASI1337), 새정(ASI1338), 새연(ASI1347), 새도(ASI1348)를 포함한 13품종, 미국, 일본, 중국 유럽지역으로부터 수집된 계통을 포함하고 있다. UFPF7 primer는 양송이 계통 간 가장 다양한 다형성 밴드를 생산하였다. UFPF7-PCR 결과에서 최근에 개발된 국내품종인 새아, 새정, 새연, 새도는 유사한 PCR다형성을 보였으나 다른 양송이 계통과는 구분되는 PCR특성을 보였다(Fig. 1). 그 외의 국내품종 ASI1001 ASI1018 ASI1019 ASI1021 ASI1022 ASI1124, ASI1216, ASI1229는 다른 미국, 유럽으로 도입된 품종과 유사한 PCR다형성양상을 보여 1960년 중 후반부터 미국 유럽지역으로 양송이 균주가 도입되었던 시점과 일치하여 균주간 유사성에의하여 나타난결과로 추정된다.

다른 Agaricus종과 A. bisporus계통 간에 PCR다형성비교에서 A. marginell, A. potobella, A. rodmanii와 Agaricus sp.인 국내균주 ASI1193, ASI1247, ASI1248는 A. bisporus와 유사한 PCR다형성이 관찰 되었으나 다른 Agaricus 종과는 뚜렷한 차이를 보였다. 특히, A. abruptibus와 A. augustus는 모든 UFPF primer에서 같은 PCR다형성이 관찰되어 동일한 종으로 사료되었다. 결론적으로 본 연구의 UFPF-PCR다형성 분석은 양송이 종내 계통의 유전적 특성과 종간 유전자원의 탐색 등에 유용하게 적용할 수 있을 것으로 사료 되었다.

A. bisporus계통의 PCR다양성 분석에 RAPD, SSR, ISSR 등이 적용되었다[1,5,7,13,14]. 양송이 microsatellite 염기서열로부터 33종류의 SSR마커를 개발하여 28 양송이 계통의 PCR다형성분석에 적용한 결과 야생주 양송이계통은 성공적으로 이용할 수 있었으나 재배품종간의 유전적 다양성검출에는 한계가 있었다[5]. SRAP와 ISSR 분석으로 재배품종과 야생주를 포함하는 305개의 양송이 수집균주를 대상으로 DNA다형성을 조사한 결과 120계통의 DNA profile을 확인할 수 있었다고 하였다[14]. Yadav 등[10]은 양송이버섯 22품종의 특성을 구분하고자 RAPD와 rDNA 염기서열의 Single nucleotide polymorphism(SNP)분석을 수행하여 2개 cluster로 구분한 바 있다. 본 연구의 UFPF-PCR와 위의 기존 연구와 비교할 때 상응 또는 보다 높은 DNA다형성을 검출할 수 있을 것으로 사료되었다.

RAPD primer의 경우는 통상적으로 10 mer의 primer가 적용되고 있으며 수십 또는 수백 종류의 primer를 탐색하여 유용 primer를 선발하여야 하며 PCR반응시에 35에서 36의 낮은 annealing온도에서 주형 DNA와 primer를 부착하기 때문에 비 특이적인 밴드가 다수 증폭될 수 있어 재현성이 문제점으로 지적되었다[5,10]. Microsatellite로부터 유래된 ISSR, SSR marker는 선제적으로 염기서열 구조가 요구되어 종이 다를 경우 사용에 한계점이 있다. URP primer는 20 mer의 염기로 구성되어 있으며 55ºC 이상의 annea-ling온도에서 PCR 반응을 수행할 수 있어 높은 재현성으로 PCR 다형성에 이용할 수 있으며[10], A. bisporus외에 다양한 Agaricus 종에서도 적용할 수 있어 종간의 상호 연관분석이 가능하다. URP primer를 이용하여 다양한 Pellinus종의 유연관계를 조사한 바 있으며 P. linteus종 특이 URP-PCR다형성 밴드를 이용하여 P. linteus 검출특이 SCAR primer를 재구성해 개발한 바 있다[15]. 따라서 계통 또는 종간 특이 UFPF-PCR산물은 교배조합의 기내 선발마커 등 육종효율을 증대시키는 데 유용하게 적용 가능할 수 있을 것으로 기대된다.

양송이 계통간 유전적 유연관계분석

본 연구에 공시한 A. bisporus계통 45균주의 유전적 유사도를 분석하기 위하여 UFPF primer에의하여 증폭된 95 PCR 다형성밴드를 이용하여 band유무에 따라 NTSYS-pc의 UPGMA program으로 dendrogram을 작성하였다(Fig. 2).

Fig.2. Genetic relationship among 45 Agaricus bisporus strains. The numbers are same to those of Agaricus strains listed in Table 1.

그 결과 3 cluster로 내에 8개의 세부 group으로 분류되었으며 group 간에는 유사성 함수가 0.75에서 0.90의 유연관계를 보였다. 한국에서 최근 개발된 새아, 새정, 새연, 새도는 Group H에 포함되었으며 0.96에서 1.0의 유사성함수로 밀접한 근연관계에 있었으며 영국 도입균주 ASI1119와는 0.9의 유사성함수를 나타내었다. 그밖에 대부분 국내 양송이계통은 group E와 F에 속하였으며 group F는 중국도입균 ASI1199과 ASI1179과 0.83의 유사성 함수를 보였다. 미국균주는 ASI1115를 제외하고 Group B와 Group G에 포함되고 있으며 네덜란드 양송이 계통(ASI1091)은 Group B에 포함하고 있으면서 미국계통ASI1074과 1.0의 유사성함수를 보여 같은 계통으로 추정할 수 있었다. 일본균주(ASI1045, ASI1047)는 프랑스균주(ASI1048, ASI1049, ASI1054)와 0.95에서 0.97까지의 높은 유사성함수를 보였다.

국내에서의 양송이 재배는 1966년에 일본으로부터 기술을 도입하기 시작하여 1967년에 유럽식 양송이재배법이 도입되면서 농가에서는 96% 이상이 국외도입 종균을 사용 되어 왔다. 최근 국내에서 교배품종으로 다향, 새아, 새정, 새연, 새도 등 국내고유 품종이 개발되어 27%가 국내품종으로 대체되고 있다[4,16]. 유럽에서는 최초 교배종인 Horst U1 개발된 이래로 동 품종으로부터 조직분리에 의한 복제계통이 신규품종으로 개발되어 유전적 배경이 매우 유사하여 형태적으로 구분하는데 한계가 있다[2]. 최근 연구에 따르면 교배친 간의 상동성 염색체의 recombination없이 교배종이 발생할 수 있으며 이핵포자는 염색체의 재분배로 인하여 표현형이 다를 수 있는 것으로 보고되고 있어 이핵포자의 특성을 조사하여 독특한 표현형의 양송이를 선발 품종화하는 경우도 있다[2]. Fig. 3은 양송이 퇴비추출배지에서 15일간 배양한 A. bisporus와 다양한 Agaricus종의 균사체의 형태적 특징을 비교한 것으로 A. bisporus는 유사한 배양적 특성을 보였으나 다른 종과는 균사 생장율과 균사체 특성이 다르게 나타났다.

Fig. 3. Mycelial characteristics of Agaricus bisporus strains and different Agaricus spp. on compost extract media.

따라서 형태적 관찰에 의한 양송이 계통간 구분은 한계가 있으며 DNA 마커에 의한 양송이 계통간 DNA profile이 유용하다는 것을 반증하고 있다.

본 연구는 UFPF primer로 양송이 계통간 또는 종간 PCR다형성을 조사하였으며 양송이 종간 종내 유전적 다양성을 확인하였다. 향후 결과산물은 품종 또는 종 특이 DNA마커 개발을 위하여 적용할 수 있으며 궁극적으로는 MAS 또는 교배조합간 분자지도 연관마커 등에 이용하여 양송이버섯의 분자육종효율을 증진할 수 있는 유용한 자료로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.