Antioxidant Activity and Inhibitory Activities of Xanthine Oxidase and Tyrosinase of Yeasts from Wild Flowers in Korea

효모와 시약

제주도와 울릉도, 통영 앞바다의 욕지도 등의 우리나라 섬들과 충남 홍성의 오서산, 대전의 계족산, 전북 정읍의 백암산 등의 야생화들에서 분리 동정한 효모들을[9-11] 실험에 사용하였다.

Xanthine oxidase와 tyrosinase, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였고, 기타 시약들은 분석용 특급을 사용하였다.

배양 상등액과 무세포 추출물의 제조

분리 효모들을 yeast extract peptone dextrose (YPD) 배지에 접종하여 30ºC에서 24시간 배양한 후 8,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액과 세포배양물을 각각 얻었다[12]. 세포배양물은 다시 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.3)에 현탁시킨 후 초음파 균체파쇄기(Vibra cell; SONICS & Materials, Newtown, CT, U.S.A.)로 파쇄하고 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 무세포추출물을 얻었다. 이들 상등액과 무세포추출물들을 동결건조시킨 후 이들을 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 7.5)에 10 mg/mL로 용해시켜 생리기능성 측정용 시료로 사용하였다[12].

생리 기능성 측정

지금까지 효모를 대상으로 연구가 많이 실시되지 않은 생리기능성 가운데 노화억제에 관련된 항산화활성과 xanthine oxidase 저해활성 및 tyrosinase 저해활성 등을 실시 측정하였다. 항산화활성(전자공여능)은 DPPH를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 시료 60 μL에 DPPH 12.5 mg을 에탄올 100 mL에 용해시킨 DPPH 용액 240 μL를 첨가한 후 10분간 반응시킨 다음 525 nm에서 흡광도를 측정하여 대조구의 값과 비교하여 활성을 계산하였다[13, 14].

미백성 tyrosinase 저해활성은 시료 25 μL에 5 mM LDOPA 50 μL, 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8)을 혼합한 후 tyrosinase 40 U을 첨가하여 37ºC에서 10분간 반응시켜 475 nm에서 흡광도를 측정한 후 대조구의 값과 비교하여 활성을 계산하였고 3반복의 평균값으로 표시하였다[8].

Xanthine oxidase (XOD) 저해활성은 시료 100 μL를 1mM xanthine 용액 200 μL와 0.05 U xanthine oxidase 100μL에 혼합하고 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5) 600 μL 첨가하여 1 mL로 정용한 후 37ºC에서 5분간 각각 반응시켰다. 1 N HCl 200 μL를 가하여 반응을 정지 시키고 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 침전된 단백질을 제거하였다. 배양상등액과 무세포추출물 중에 함유되어 있는 uric acid 함량을 분광분석기(UV-1601; Shimadzu, Kyoto, Japan)로 292 nm에서 흡광도를 측정하여 정량한 후 다음과 같이 각각의 xanthine oxidase 저해활성 을 계산하였고[15], 위와 같이 얻은 저해활성 결과들을 3반복의 평균값으로 표시하였다.

Xanthine oxidase 저해활성(%) = [1 − {A(시료구) − B(시료구 blank) / C(대조구)}] × 100

야생화에서 분리한 효모의 항산화활성과 xanthine oxidase 및 tyrosinase 저해활성

제주도와 욕지도 및 울릉도 등 우리나라 주요 섬들의 야생화들에서 분리 동정한[9, 11] 50종 141 효모 균주들의 생리기능성들을 배양상등액과 무세포추출물로 구분하여 측정한 후 생리기능성별로 활성이 우수한 효모들을 5개씩 선별한 결과는 Table 1과 같다. 항산화 활성은 제주도 성산일출봉 야생화에서 분리한 Rhodosporidium paludigenum 89-J-3의 배양상등액이 19.0%로 가장 높았고 무세포추출물들은 대부분 활성을 보이지 않았다. 항통풍성 XOD 저해활성은 울릉도 나리분지의 야생화에서 분리한 Kuraishia capsulata UL40-2의 무세포추출물에서 46.4%로 비교적 높은 활성을 보였으나 배양상등액에서는 Rhodotorula graminis UL20-3이 25.7%를 보였을 뿐 대체로 20% 미만으로 미약하였다. 또한 미백성 tyrosinase 저해활성은 제주도 서귀포 시내 야생화에서 분리한 Starmerella bombicola 80-J-1의 무세포추출물에서 36.2%의 활성을 보였고 대부분 배양상등액 보다는 무세포추출물에서 비교적 활성이 높았다.

이 결과들은 Hyun 등[12]이 전라북도 고군산열도의 선유도 일대에서 2014년 4월 중순에 개화한 꽃들로부터 분리한 효모들 중 Metschnikowia reukaufii SY44-6의 배양상등액이 각각 49.6%의 XOD 저해활성과 38.4%의 tyrosinase 저해활성을 보였고 Cryptococcus aureus SY40-1의 무세포 추출물이 46.5%의 XOD 저해활성을 보였다는 결과와 유사하였다. 그러나 서울 구로동의 야생화에서 분리한 Pseudozyma hubeiensis 228-S-1의 무세포추출물의 XOD 저해활성(19.6%)[9]과 Han 등[17]이 덕유산 야생화에서 분리한 Sporobolomyces phaffii JS00583의 40.4% 보다는 높은 결과였다.

한편 계족산과 오서산 및 백암산 등 우리나라 산에 서식하는 야생화들에서 분리 동정한[10] 32종 66균주 효모들의 무세포추출물과 배양상등액들의 생리기능성을 측정한 후 위와 같이 생리기능성별로 우수효모들을 선별한 결과는 Table 2와 같다. 항통풍성 XOD 저해 활성은 Sporobolomyces ruberrimus 121-Z-3의 무세포추출물이 48.3%로 가장 높았고 Pseudozyma antarctica 123-Z-4와 Rhodotorula glutinis 115-Z-1의 무세포추출물들도 각각 46.3%와 45.3%로 비교적 높았으며 Filobasidium floriforme 396-JB-1의 배양상등액에서도 41.8%를 보였다. 그러나 항산화 활성은 Rhodos poridium fluviale 399-JB-1의 배양상등액에서 22.0%를 보였을 뿐 대체로 낮았고 tyrosinase 저해활성도 5균주들의 배양상등액에서 28.6~29.9%를 보였으나 무세포추출물에서는 20% 미만으로 미약하였다.

Table 1. Physiological functionalities of five potent species from total 141 yeast strains of wild flowers collected in Yokjido, Ulleungdo, Jeju-do, Korea

^aSource of description [9, 18]; bn.d, not detected or < 5%.

Table 2. Physiological functionalities of five potent yeast species from total 66 yeast strains of wild flowers collected in Mt. Gyejok, Mt. Oseo and Mt. Baekam, Korea

^aSource of description [9, 18]; bn.d, not detected or < 5%.

이 결과들은 Han 등[17]이 2014년 7월에 개화한 덕유산 일대 야생화에서 분리한 Sporobolomyces phaffii JS00583 배양상등액의 XOD 저해활성(40.4%)보다는 높았으나 Cryptococcus magnus JS00570의 배양상등액의 미백성 tyrosinase 저해활성(36.1%)보다는 낮은 결과였다.

Fig. 1. Effect of cultural times of Kuraishia capsulata UL40-2(□) and Sporobolomyces ruberimus 121-Z-3(▨) on the production of xanthine oxidase inhibitor.

항통풍성 xanthine oxidase 저해물질의 최적 생산 조건

위와 같이 섬과 산 지역 야생화들에서 분리한 효모들의 생리기능성 중에서 항통풍성 xanthine oxidase 저해활성이 가장 우수하였던 Kuraishia capsulate UL40-2와 Sporobolomyces ruberrimus 121-Z-3를 최종 선정하였다. 이들을 이용한 XOD 저해물질 생산 조건을 조사한 결과 Fig. 1과 같이 Kuraishia capsulate UL40-2와 Sporobolomyces ruberrimus 121-Z-3 각각을 YPD 배지에 접종하여 30ºC에서 배양하였을 때 배양시간이 경과함에 따라 XOD 저해활성이 증가하여 배양 24시간 후 얻은 무세포추출물이 47.2%와 49.5%로 가장 높은 XOD 저해활성을 보였다.

또한 yeast extract malt extract (YM), Luria bertani (LB), YPD, tryptic soy broth (TSB)와 potato dextrose broth (PDB) 배지 등을 이용하여 두 효모들의 XOD 저해물질 생산에 미치는 배지의 영향을 검토한 결과 Kuraishia capsulata UL 40-2는 YPD와 YM 배지에서 각각 47.9%와 46.5% 를 보였고 PDB 배지와 TSB 배지에서는 30% 미만의 낮은 활성을 보였다(자료 미제시). Sporobolomyces ruberrimus 121-Z-3 역시 YM 배지와 YPD 배지에서 배양하였을 때 가장 높은 저해활성(49.8%, 49.0%)을 보여 두 균주 모두 YPD 배지나 YM 배지가 XOD 저해물질 생산에 적당한 것 으로 생각된다.

이 결과는 Hyun 등[9]이 서울 구로동 일대에서 2012년 개화한 꽃에서 분리한 Pseudozyma hubeiensis 228-S-1을 YPD 배지에 접종하여 30ºC에서 48시간 배양하여 얻은 무세포추출물의 XOD 저해활성(19.6%)보다는 배양시간이 짧았고 더 높은 활성이었다. 그러나 Jang 등[17]의 느타리버섯 자실체의 물 추출물의 78.3%보다는 매우 낮은 활성이었다.

Xanthine oxidase는 핵산관련물질인 xanthine을 산화시켜 요산을 생합성하는데 관여하는 rate-limiting 효소로서 이러한 요산이 관절부위에 축적되어 통풍을 유발시킨다[9]. 통풍은 최근 발병이 급속히 증가하고 있는 만성 소모성 질환의 일종이며 아직까지 효능이 우수하면서 부작용이 적은 항통풍성 건강 소재 개발은 매우 미진한 실정이다[9]. 따라서 본 연구 결과들은 비록 느타리버섯 자실체의 물추출물보다 활성이 낮지만 버섯 자실체의 배양기간(3~4주) 등 을 감안하였을 때 배양이 용이하고 배양시간이 짧은 이점이 있는 효모에서의 생산은 경제적 측면에서 더 유리할 것이고 새로운 항통풍성 건강 소재의 산업화에 기초자료로 활용할 수 있을 것이다.