서 론
벼키다리병은 대표적인 종자 전염성 병해로 Fusarium fujikuroi Nirenberg에 의해 발생한다. 농촌진흥청에 따르 면 이 병의 본답 발병율은 2006년 28.8%에서 2012년에는 20%로 감소하는 추세였으나, 2013년에는 31%로 크게 증 가하여 문제시된 바 있다. 키다리병의 방제를 위해서는 약 제를 사용하여 종자를 소독하는 방법이 가장 효과적인 것 으로 알려져 있으나 최근에는 약제 소독을 실시한 종자에 서도 키다리병이 발생하여 이에 대한 원인 분석이 필요한 실정이다.
국내에서 벼키다리병에 대한 연구는 1980년대 초반에 이루어졌는데, 키다리병의 발생 생태 및 피해 해석에 관한 연구가 주로 수행되었다[1, 2]. 이후, 국내에서 키다리병은 문제되지 않았다가 2002년 이후 발생이 증가하면서 종자 소독제의 약량 및 약액 온도, 처리 시간에 따른 효과 검정 [3], prochloraz와 fludioxonil 혼용 침지에 의한 방제 방법 [4] 등 종자소독과 관련된 연구가 진행되었으며, 그 후에는 prochloraz에 대한 약제 저항성 및 교차 저항성에 대한 연 구가 일부 수행된 바 있다[5, 6].
Prochloraz는 1977년에 처음 사용된 DMI계(sterol 14 α- demethylase inhibitor) 살균제로서 전 세계적으로 약 50개 국에서 30종 이상의 작물에 사용되고 있다[7]. 특히 prochloraz는 benzimidazole계 살균제 저항성인 식물병원균에 대해 우수한 방제 효과를 나타내기 때문에, benomyl 저항 성을 나타낸 복숭아 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola)의 방제에 사용되었으며[8], 아마 종자병원균인 Phoma exigua var. linicola의 방제에도 사용되고 있다[9]. 그러나 프랑스에서 맥류에 eyespot을 일으키는 Tapesia균과 목화 반쪽시 들음병을 일으키는 Verticillium dahlia균에서 prochloraz 저항성 균주가 보고된 바 있다[10, 11]. Prochloraz는 침투 이행성이 뛰어난 약제이므로 벼키다리병의 방제를 위한 종자 소독제로 1983년에 등록되어 최근까지도 사용되고 있다. 그러나 2006년부터 2009년 사이에 국내에서 분리한 키다리병균의 prochloraz 저항성 분포가 보고되었으며[5, 6], 중국의 경우 장수(Jiansu)지역에서 분리한 키다리병 균 주에서 약 82%가 prochloraz 저항성임을 보고하였다[12]. 특히 일본에서는 1980년대 여러 지역에서 종자소독을 실 시하였음에도 벼키다리병이 대발생하였는데, 그 원인으로 benomyl 저항성 균의 출현을 보고한 바 있다[13].
따라서 본 연구에서는 최근 약제 소독을 실시한 종자에 서도 키다리병이 발생하는 원인을 구명하기 위하여, 2006 년부터 2007년, 그리고 2013년부터 2014년에 걸쳐 분리한 균주를 대상으로 벼에 대한 병원성을 확인하고, 병원성이 확인된 균주에 대해 한천희석법을 이용하여 prochloraz에 대한 감수성 정도를 조사하였다. 그 결과를 바탕으로 연도 별 저항성 변이를 분석하였고, 우리나라에 분포하는 벼키 다리병균의 prochloraz 약제에 대한 저항성 기준을 설정하 였다.
재료 및 방법
벼키다리병균 분리 및 보존
2006년부터 2007년과 2013년부터 2014년에 걸쳐 전국 에서 벼 키다리병을 수집하였다. 벼 육묘기부터 등숙기까 지 벼키다리병에 감염된 식물체 또는 종자를 수집하여 균 을 분리하였다. 채집한 시료 중 유묘는 지제부를 약 5 mm 길이로 절단하였고, 종자는 그대로 1% 차염소산나트륨 용 액으로 1분간 표면 살균한 뒤, 멸균수로 세척하고 건조하 여 물한천배지에 치상하였다. 치상 5~7일후, 현미경으로 관찰하여 전형적인 사슬 모양의 분생포자를 확인하고, 단 포자 분리하였다. 또한, 본답후기에 벼줄기에 키다리병이 발생한 경우, 벼 줄기를 직접 습실처리한 후 균총으로부터 단포자 분리를 실시하였다. 2006년부터 2007년에는 총 139개, 2013년부터 2014년에는 총 451개 균주를 분리하였 으며, 단포자 분리한 균주는 감자한천 사면배지(potato dextrose agar, PDA)에 배양하고, 10ºC에 보관하면서 실험 에 사용하였다.
병원성 검정
분리한 균주의 병원성 확인을 위하여 물한천배지가 담긴 시험관을 이용하여 병원성 검정을 수행하였다. 벼 종자(추 청벼)를 철저하게 소독하기 위하여 1% 차염소산나트륨 용 액에 1시간 동안 침지하고 건조시킨 후, prochloraz 500배 액에 8시간 동안 침지 처리하고 세척하였다. 다시 12시간 동안 건조시킨 후, water agar 배지가 10 mL 들어있는 시험관(직경 30 mm, 길이 200 mm)에 파종하여 키다리병 감 염여부를 조사하였다.
분리 균주의 포자현탁액을 만들기 위하여 균주를 PDA 배지에 접종하여 25ºC에서 10일간 배양하였다. 멸균수를 PDA plate에 부어 포자현탁액을 제조하고, haemacytometer로 1 × 106 spores/mL의 농도로 조절하였다. 포자현탁액 1 mL에 소독한 종자 20립을 넣어 25ºC에서 48시간 침지 한 뒤 water agar가 들어있는 시험관에 3립씩 파종하였고, 대조구는 멸균수를 사용하였다. 파종 후 28ºC, 12 h light/ 12 h dark 조건인 배양기에서 2주간 생육시킨 후 발병 정 도를 조사하였다.
발병 정도는 Amatulli 등[14]의 방법을 변형하여 사용하 였다. 병지수 0은 병이 전혀 걸리지 않은 것, 1은 키가 크 지는 않으나 약간 연녹색 띠는 것, 2는 연녹색을 띠면서 3 엽이 나오지 않으며 키가 약간 큰 것, 3은 연녹색을 띠면 서 3엽이 나오지 않고, 키가 병지수 2에 비해 약간 더 큰 것, 4는 연녹색을 띠면서 3엽이 나오지 않고, 키가 대조구 에 비해 2배 정도 큰 것, 5는 전형적인 키다리 증상 혹은 고사한 것으로 하였으며, 병 지수를 100으로 환산하여 발 병 정도를 조사하였다.
벼키다리병균의 prochloraz에 대한 약제반응 조사
Prochloraz (a.i. 25%, EC)에 대한 키다리병균의 감수성 정도를 조사하기 위하여 한천희석법을 이용하여 균사생장 억제 정도를 조사하여 비교하였다. 병원성이 확인된 2006 년부터 2007년 분리 균주 및 2013년부터 2014년 분리 균 주를 PDA 배지에 접종하여 25ºC에 7일간 배양하였고, cork borer(직경 5 mm)를 이용하여 균총을 절단하였다. 약제는 멸균수에 용해시켜 PDA 배지에서의 최종농도가 각각 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.390625 μg/mL이 되도 록 첨가하였고, 약제를 혼합한 PDA 배지에 균총을 접종하 였다. 병원균을 접종한 배지는 25ºC에서 7일간 배양한 후 자란 균총의 직경을 측정하였으며, 약제를 첨가하지 않은 PDA 배지에서의 균총 직경과 비교하여 균사생장 억제율 (%)을 계산하였다. SigmaPlot version 12.3 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) 프로그램을 이용하여 균사생장 을 50% 억제하는 농도인 effective concentration of 50% (EC50) 값을 계산하였고, 균사를 완전히 억제하는 최소억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 구하여 균주의 저항성, 감수성 정도를 비교 분석하였다.
균사생장 억제율(%) = [1 − (약제 배지에서의 균총직경/무처리 배지에서의 균총직경)] × 100
결과 및 고찰
분리 균주의 병원성 검정
2006년부터 2007년에 분리한 139개 균주 중 124개 균주에서 병원성이 확인되었고, 2013년부터 2014년에 분리한 451개 균주 중 375개 균주가 병원성이 있는 것으로 나타났다(Table 1).
Table 1. Total numbers of isolates and virulent isolates by pathogenicity test of isolates from rice during 2006~2007 and 2013~ 2014, respectively
aDisease incidence was determined by mean of disease index on five replications of each isolate using rice seeds soaking inoculation, on a 1~100 scale.
일반적으로 벼키다리병은 F. fujikuroi에 의해 발생하는 것으로 알려져 있으나 말레이시아, 인도네시아 등의 동남아시아 지역에서는 Fusarium andiyazi, Fusarium proliferatum, Fusarium verticillioides 등 Gibberella fujikuroi 종 복합체에 속하는 종들도 병을 일으킬 수 있다고 보 고한 바 있다[15, 16]. 그러나 Mohd Zainudin 등[17]은 벼 에서 분리한 F. fujikuroi, F. proliferatum, F. sacchari, Fusarium subglutinans, F. verticillioides를 대상으로 병원성 검 정을 수행한 결과, F. fujikuroi만이 키다리병을 일으킨다고 보고하였으며, 벼에서 분리한 모든 F. fujikuroi가 병을 일 으키는 것이 아님을 증명하였다. 본 실험에서도 형태적, 배 양적 특성과 TEF (translation elongation factor 1 alpha) 유 전자의 염기서열 분석에 의해 F. fujikuroi로 동정된 균주임 에도 병원성이 없는 균주가 27개 분리되었으며, 병을 일으 키는 균주 중에는 F. fujikuroi외에 다른 종으로 동정된 균 주가 일부 확인되어 향후 이들 균주에 대한 추가적인 연구 가 필요할 것으로 생각된다(데이터 미제시).
연도별 최소억제농도(MIC) 및 EC50 값의 변화
실내검정에 의해 병원성이 확인된 499개 균주에 대해 한 천희석법을 이용하여 약제반응을 조사한 결과, 2006년부터 2007년과 2013년부터 2014년에 분리한 균주의 MIC 값의 분포도는 각각 Fig. 1A, Fig. 1B와 같이 나타났다. 2006년과 2007년에 분리한 균주 및 2013년과 2014년에 분리한 균주는 각각 1년 사이에 MIC 값의 변화가 크게 나타나지 않았 으며, 이를 근거로 하여 본 연구에서는 2006년부터 2007년 분리 균주를 한 그룹으로, 2013년부터 2014년 분리 균주를 다른 한 그룹으로 분류하여 prochloraz에 대한 저항성 분석 을 수행하였다. 그 결과 2006년부터 2007년 분리 균주는 MIC 값이 3.125~6.25 μg/mL인 균주가 가장 높은 빈도로 분포하는 양상이었으나, 2013년부터 2014년에 분리한 균 주는 MIC 값이 6.25~12.5 μg/mL의 농도에서 분포 비율이 가장 높았다. 또한 Fig. 1C에서 보는 바와 같이 2006년부 터 2007년에 비해 2013년부터 2014년 균주의 MIC 값 분 포가 오른쪽으로 이동한 것으로 나타났으며, 이는 국내에 분포하는 키다리병균의 prochloraz에 대한 저항성 정도가 상승하고 있음을 의미한다.
Fig. 1. Minimum inhibitory concentration (MIC) of prochloraz against the mycelia growth of Fusarium species isolated from infected rice plants in 2006~2007 and 2013~2014. (A) and (B) indicated MIC pattern of prochloraz against the mycelia growth of isolates collected in 2006~2007 and 2013~2014, respectively. (C) showed change of MIC pattern of prochloraz against the mycelia growth of isolates collected between 2006~2007 and 2013~2014.
한편, 분리 균주를 대상으로 균사생장을 50% 억제하는 농도인 EC50 값을 조사하여 그래프로 나타낸 결과, Fig. 2에 서 보는 바와 같이 2013년부터 2014년 분리 균주의 EC50 값 의 범위가 2006년부터 2007년 분리 균주에 비해 크게 넓 어진 것을 볼 수 있다. 즉 2006년부터 2007년 분리 균주의 EC50 값의 최소값은 0.0001 μg/mL, 최대값은 4.281 μg/mL 인데 비해 2013년부터 2014년 분리 균주의 경우 최소값이 0.0016 μg/mL, 최대값은 16.7947 μg/mL로 나타났다. 또한 2006년부터 2007년 분리 균주의 평균 EC50 값은 0.3142 μg/ mL이었으며, 2013년부터 2014년 분리 균주는 0.8124 μg/ mL로 나타나 저항성이 상승하고 있음을 알 수 있다. Shin 등[5]은 2007년에 충북지역에서 분리한 키다리병균의 EC50 값의 범위를 0.02~1.78 μg/mL, 평균값은 0.25 μg/mL로 보고하였고, Lee 등[6]은 2006년부터 2009년까지 국내에서 분리한 118개의 키다리병균에 대한 prochloraz 저항성을 검정한 결과, EC50 값의 범위는 0.002~1.548 μg/mL이며, 평 균값은 0.207 μg/mL로 보고하였다. 이와 같은 결과는 본 연구에서의 평균 EC50 값인 0.3142 μg/mL와 약 0.1 μg/mL 의 차이를 나타냈으나, EC50 값의 범위는 0.0001~4.281 μg/ mL로 큰 차이를 나타냈다. 이는 키다리병균의 분리 연도, 지역 및 대상 균주수, 분리 균주의 병원성 여부 등에 대한 차이 때문인 것으로 생각된다.
벼키다리병균의 prochloraz에 대한 저항성 기준
국내에서 분리한 균주의 prochloraz에 대한 저항성 기준 을 설정하기 위하여 2006년부터2007년에 분리한 균주의 균사생장 억제율을 그래프로 나타낸 결과 8개의 균주가 저항성으로 그룹화되는 것으로 나타났으며, 이들의 EC50 값 범위는 0.6004~4.281 μg/mL로 조사되었다(Fig. 3).
2007년 충북지역에서 분리한 키다리병균의 경우, 저항성 기준 EC50 값을 0.5 μg/mL로 결정하였으며, 저항성 균주는 0.16~20.0 μg/mL 사이의 약제 농도에서 균사생장 억제율 이 큰 폭으로 감소한다고 하였다[5]. 또한 Lee 등[6]도 prochloraz 감수성 균주들과 확연한 차이를 보이는 EC50 값 인 0.5 μg/mL를 저항성 기준으로 결정하면서 2 μg/mL의 농도에서 저항성 균주의 균사생장 억제율이 급격히 감소 한다고 하였다. 이 저항성 기준을 바탕으로 분석했을 때, 2007년 충북지역에서 분리한 키다리병균의 저항성 분포 비율은 13.8%이었고, 2006년부터 2009년에 전국에서 분리 한 균주 역시 13.6%로 조사되었다. 그러나 본 연구에서는 저항성과 감수성 균주간 균사생장 억제율은 확연한 차이 를 나타내지는 않았으며, 약 1 μg/mL의 prochloraz 농도 에서 8개 균주의 균사생장 억제율이 60% 이하로 감소하는 것으로 나타나 이들 균주가 저항성인 것으로 판단하였고, 저항성 기준 EC50 값은 0.6 μg/mL로 하는 것이 타당한 것 으로 생각된다.
Fig. 3. Baseline of fungicide response resistant to prochloraz on isolates of Fusarium species isolated during 2006~2007 in Korea.
8개의 저항성 균주는 모두 6.25 μg/mL 이 상의 MIC 값을 나타내었으나, 감수성 균주의 MIC 값 역시 6.25 μg/mL 이상인 것이 일부 존재하므로 prochloraz에 대한 키다리병균의 저항성 기준 설정에는 EC50 값을 사용 하는 것이 타당할 것으로 판단된다. 본 연구에서 결정한 저항성 기준을 바탕으로 분석한 결과, 2006년부터 2007년 에 분리한 균주에서는 저항성 균주가 약 6.5%였지만 2013 년부터 2014년 분리 균주에서는 41.6%로 저항성 균주의 빈도가 크게 증가한 것으로 나타났다(Fig. 4). Yang 등[18] 은 밀의 병원균인 Mycosphaerella graminicola와 triazole계 살균제인 cyproconazole의 상호작용 연구를 통해 병원균 의 병원성(virulence)과 약제 내성이 정의 상관관계가 있 다고 하였다. 특히 이것은 기주-병원균의 양적 저항성과 관련되며, 병원성과 약제 내성에 관여하는 유전자의 다면 발현 때문이라고 하였다. 또한 보호용 살균제인 chlorothalonil을 처리한 품종에서 분리한 M. graminicola의 병원성이 약제를 처리하지 않은 포장에서 분리한 병원균에 비 해 더욱 강한 것으로 나타났다[19]. 따라서 국내에서 벼키 다리병 방제를 위해 prochloraz를 계속해서 사용함에 따라 키다리병균의 병원성이 어떤 방향으로 변화하였는지에 대 한 조사가 필요할 것으로 생각된다.
지역별 prochloraz 저항성 균주 분포 비교
연도별 분리 균주를 대상으로 prochloraz 저항성 균의 분포 비율을 지역별로 구분하여 비교한 결과 2006년부터 2007년 균주에서는 충북, 전북, 경남지역에 저항성 균주가 분포하지 않는 것으로 나타났으나, 2013년부터 2014년의 경우 전국적으로 prochloraz 저항성 균주의 분포가 확인되 었고, 분포 비율도 크게 증가하였다(Table 2). 특히 전남지 역은 분리 연도에 관계없이 저항성 분포 비율이 가장 높은 것으로 조사되었다. 또한 각 지역별 평균 EC50 값을 비교해 보면 2006년부터 2007년 분리균의 경우 0.1698(경남)~ 0.5262(전남)의 범위였으나, 2013년부터 2014년에는 0.4862 (경기)~1.1974(전남)로 크게 증가하였으며, 저항성 균주의 분포 비율과 동일하게 전남지역의 평균 EC50 값이 가장 높 은 것으로 나타났다. 2006년부터 2009년까지 분리한 균주 를 대상으로 한 동일한 조사에서도 전남지역에서 prochloraz 저항성 균주의 비율이 60%로 가장 높았으며, 이는 종 자를 자가 채종하여 연속적으로 사용하면서 prochloraz에 지속적으로 노출되고, 이것이 저항성 균의 출현을 야기시 켰기 때문이며, 이것이 전남지역에서 키다리병이 심하게 발생하는 원인이라고 하였다[6]. 본 연구에서도 전남지역 의 prochloraz 저항성 비율과 평균 EC50 값이 다른 지역에 비해 현저히 높은 것으로 조사되었으며, 이에 대한 지속적 인 모니터링과 약제 저항성 관리 방안 마련이 필요할 것으 로 생각된다.
이와 같은 결과에 따르면 최근 키다리병에 대한 약제 방 제 효과가 저하되고, 병 발생이 다시 증가하고 있는 원인 중 하나는 종자 소독약제로 가장 많이 사용하고 있는 prochloraz에 대한 저항성 균의 분포가 증가하기 때문인 것으 로 추정된다. 따라서 키다리병 방제를 위한 효율적인 종자 소독방법을 개발하기 위해서는 신속하고, 체계적인 약제 저항성 키다리병균의 모니터링 시스템 구축이 필요하며, prochloraz뿐만 아니라 현재 종자 소독약제로 사용되고 있 는 여러 약제에 대한 저항성 분포를 조사하고, 다른 약제 와의 교차 저항성 및 다중 저항성을 분석하는 등의 추가적 인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
적 요
국내에 분포하는 벼키다리병균의 prochloraz에 대한 저 항성 정도를 조사하기 위하여 연도별로 균주를 수집하고, 병원성을 검정하였으며, 한천희석법을 사용하여 각 균주 의 prochloraz에 대한 minimum inhibitory concentration (MIC) 값과 effective concentration of 50% (EC50) 값을 조 사하였다. 그 결과 2006년부터 2007년 분리균의 MIC 값은 3.125~6.25 μg/mL인 균주가 가장 높은 빈도로 분포하였고, 2013년부터 2014년 분리균의 MIC 값은 6.25~12.5 μg/mL 의 농도에서 분포 비율이 가장 높았다. 또한 2006년부터 2007년 분리 균주의 평균 EC50값은 0.3142 μg/mL이었으며,
Table 2. Frequency of resistant isolates to prochloraz and mean of EC50 value from each province in Korea
EC50, effective concentration of 50%.
2013년부터 2014년 분리 균주는 0.8124 μg/mL이었다. 2006년부터 2007년 분리 균주의 prochloraz에 대한 저항성 기준 EC50값은 0.6 μg/mL로 하는 것이 타당한 것으로 생 각된다. 이 기준에 의한 저항성 균주의 비율은 2006년부터 2007년 분리 균주는 약 6.5%였고, 2013년부터 2014년 분 리 균주에서는 41.6%로 저항성 균주의 빈도가 크게 증가 한 것으로 나타났다.
