서론
제주도 한라산, 곶자왈, 오름 등에서 조사된 자생하는 고 등균류는 총 2문 9강 23목 83과 258속 718종 22변종 3아 종 12품종으로 743 분류군임이 보고되었다[1, 2]. 한국균 류목록 [3]에 의하면 국내에서 자생하는 고등균류는 2013 년 현재 1,900여 종이라고 기록하고 있는 바, 제주도는 고 온다습한 기후환경으로 인해 좁은 면적임에도 매우 다양 한 버섯 상을 보이고 있음을 알 수 있다[2]. 본 보고에서는 최근 9년 동안 제주지역에서 채집되어 제 주대학교 친환경농업연구소 생물표본실에 보관되어 있는 야생버섯 표본들 중 국내 미기록종으로 확인된 5종을 발굴 하여 버섯의 특징에 맞는 각각의 형태 및 미세구조적 특징 을도해하였다. 이는 국내에 자생하는 야생버섯류의 종 다 양성과 분포상 파악을 위한 기초 자료로 이용되리라 본다.
재료 및 방법
2006년부터 2014년까지 채집된 제주도에 자생하는 야생버섯 2,000여점 중에서 국내 미기록 종으로 추정되는 버섯 의 형태와 미세구조를 관찰하였다. 형태적 관찰은 건조된 자실체의 일부를 5 mm 내외의 절편으로 만들어 모든 세포 가 원래 상태로 회복되도록 70% 에탄올과 증류수에 각각 2~3분간 담가 시료가 충분히 부풀어질 때까지 반복하였다. 부드러워진 절편을 수수깡에 끼워 면도날로 가능한 얇게 절단한 후, 1% congo red 용액과 1% phloxine 용액으로 각 각 2~3초간 염색하였다. 포자, 균사 및 조직 상태를 광학 현미경(Axiplan2; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 검경하였다. 또한 드로잉현미경(Zeize Daiplan, Germany) 으로 포자, 담자기, 조직 등을 관찰하였다.
미세구조를 관찰하기 위해서 시료를 5× 5 mm의 크기로 3~4개를 잘라서 2% glutaraldehyde에 담가서 2시간 동안 1차 고정하였다. Phosphate buffer로 15분씩 3차례 씻은 후 1% osmium tetroxide에 담가 4ºC의 냉장고에 2시간 동안 2차 고정한 후 다시 phosphate buffer로 씻어냈다. 그 후 상 온에서 ehtanol 50%, 70%, 90%, 95%, 100%의 농도로 각 10분씩 탈수시키고 isoamyl acetate 30%, 50%, 70%, 100% 로 각 10분씩 치환시켰다. 치환된 시료를 critical point dryer (SPI 13200; SPI Supplies, West Chester, PA, USA)를 이용해 임계점 건조시키고, sputter cater로 10 mA에서 120 초 간 gold (Au/pb)로 코팅시킨 후, 주사전자현미경(JSM6700F; JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 포자 및 담자기의 미세구조를 관찰하였다. 관찰된 버섯은 기존의 버섯분류 관련 문헌 등[4-6]과, DNA 시퀀싱 결과, 원기재문 등을 비 교하여 동정하였다. 동정된 종의 학명은 Index Fungorum 의 2015년 현재 명명에 준하였다[7].
DNA염기 서열 분석을 통한 재 동정
DNA 염기서열 분석을 통한 재동정을 위하여 보관된 건 조시료를 Kim 등[8]의 drilling 방법으로 genomic DNA를 추출하였고 , 프라이머는 ITS1F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A)와 ITS4 (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR) 반 응을 수행하였다. 각 반응의 단계는 먼저 95ºC에서 5분간 predenaturation한 후, 94ºC에서 1분간 denaturation, 56ºC 에서 1분간 annealing, 72ºC에서 1분간 elongation을 하였 고 이 과정을 35 cycle 반복하였다. 최종적으로 72ºC에서 10분간 안정화시킨 후 4ºC에서 보관하였다. PCR 산물은 1% 아가로스겔에서 30분간 전기영동하고 예상되는 크기의 band를 확인하였다. 염기서열분석은 sequencing 분석전문 업체인 마크로젠에 의뢰하였고 분석된 염기서열들은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 동정 하였다 [9].
결과 및 고찰
Ramariopsis subtilis (Pers.) R.H. Petersen, Mycologia 70(3): 668 (1978)
Position in classification: Clavariaceae Agaricales, Agaricomycetidae, Agaricomycetes, Basidiomycota Synonym: Clavaria subtilis Pers., Comm. fung. clav. (Lipsiae): 51 (1797) Clavulinopsis subtilis (Pers.) Corner 1950.
Habits & Habitats: 제주도에서는 상록활엽수림 지역인 동백동산 곶자왈 내의 구실잣밤나무 아래 낙엽이 쌓인 토 양 위에서 발생하며, 무리지어 군생하였다.
Specimen examined: 제주도 조천읍 선흘리 동백동산에 서 채집. RSNB NO: JUK13078. 2013. 7. 7.
Morphological characteristic: 자실체의 길이는 1~4 cm 이고 지름은 0.5~1 mm 굵기의 뿔형으로 가지를 치며 다시 분지가 된다. 끝은 뾰족하고 육질은 매끄럽고 부드럽다. 자 실체의 색은 담갈색에서 갈색으로 된다(Fig. 1A, 1B).
포자는 광타원형이며 4~6 µm이고 표면은 매끄럽다(Fig. 1D, 1E) [4, 10]. 담자기는 크기가 25~30 × 5~8 µm이고 곤 봉형이며 (Fig. 1C, 1F), 클램프가 있다(Fig. 1G).
Fig. 1. Photographs and microscopic images of Ramariopsis subtilis. A, B, Fruit bodies; C, F, Basidia; D, E, Spores; G, Hyphae. (scale bars: A, B = 1 cm).
Remarks: 볏싸리버섯과 유사하나 자실체가 현저하게 소 형이며 자실체 아래에서부터 분지가 많이 되는 특징이 있 다 . 비가 내릴 때 물이 일시적으로 고였다가 빠져나가는 다 소 습한 곳에서 군생한다. Ramariopsis는 Donk(1933)에 의 해 Clavaria junzei를 type 종으로 하여 Clavaria의 아속으 로 기재되었다[11]. 이 이름은 Ramaria속과의 macromorphological의 유사성으로 인해 이름이 붙여졌다. 이 taxa는 본래 type species인 Clavaria angulispora, C. pulchella, C. pyxidata 와 C. subtilis를 포함하고 있다.
Coltricia pusilla Imazeki & Kobayasi, Trans. Mycol. Soc. Japan 7: 42 (1966)
Position in classification: Hymenochaetaceae, Hymenochaetales, Incertae sedis, Agaricomycetes, Agaricomycotina, Basidiomycota, Fungi Synonym: Coltricia pusilla Imazeki & Kobayasi 1966 Coltricia indica Baltazar, in Baltazar & Silveira, Mycotaxon 119: 386 (2012) Coltricia parvula J.R. Sharma & J.E. Wright, in Wright, Mycotaxon 61: 419 (1997) Coltricia pusilla J.R. Sharma & J.E. Wright, Bull. bot. Surv. India 31(1-4): 182 (1992) [1989] Coltriciella pusilla (Imazeki & Kobayasi) J.E. Wright, Mycotaxon 61: 419 (1997)
Habits & Habitats: 하천변 침엽수 및 상록활엽수림이 혼 생하는 혼효림 내에서 많이 부식된 곰솔 고사목에 발생하 였다.
Specimen examined: 서귀포시 남원읍 신례리의 신례천 변에서 채집. RSNB NO: JUK13106. 2013. 7. 28. Morphological characteristic: 자실체의 크기는 2~10 × 2~7 mm 이고 두께는 0.2~0.3 mm로 얇고 작은 버섯이다 (Fig. 2A). 자실체는 전체가 갈색이며 털이 없고 혁질이며 질기며 자실층은 다각형의 관공형이다. 자루는 원통형이며 편심생이고 굵기는 0.5~1 mm, 길이는 1 cm로 갓과 같은 색이다(Fig. 2B).
Fig. 2. Photographs and microscopic images of Coltriciella pusilla. A, B, Fruit bodies; C, F, Basidia; D, E, Spores; G, Hyphae.(scale bars: A, B = 1 cm)
포자는 4~6 µm이고 타원형 또는 광타원형이며 겉은 매 끄럽다(Fig. 2C~2E). 담자기는 6.5~7.5 × 4.5~5 µm로 짧은 곤봉형이다 (Fig. 2F) [12, 13]. 클램프가 없다(Fig. 2G).
Remarks: 상록활엽수와 침엽수가 혼재하는 숲 속의 침엽 수 고사목 그루터기에서 발생하였다. Coltricia속은 국내에 는 C. cinnamomea, C. cumingii, C. dependens, C. montagnei, C. perennis, C. spathulata 등 6종이 기록되어 있다[3]. 이와 유사한 종으로는 C. dependens가 있으나 이 종은 버섯 자루가 짧고 벌집 모양으로 숙주체에 매달려 붙어 있으나 C. pusilla는 1 mm 굵기의 자루가 1 cm 정도의 길이로 발생하며 편심생으로 자루가 달리며 직립하여 자실체가 발생 하는 점이 다르다.
Lactifluus ochrogalactus (Hashiya) X. H. Wang, Mycotaxon 119: 485 (2012)
Position in classification: Russulaceae, Russulales, Agaricomycetes, Basidiomycota Synonym: Lactarius ochrogalactus Hashiya, in Wang, Hashiya & Verbeken, Mycoscience 47(4): 232 (2006)
Habits & Habitats: 서어나무, 졸참나무 등의 낙엽활엽수 림이 우점하는 숲 지상에서 주로 여름에 발생한다.
Specimen examined: 한라산 관음사 주변 탐라계곡에서 채집 . RSNB NO: JUK-13040. 2013. 6. 29.
Morphological characteristic: 유균의 경우는 중앙 부분이 돌출한 천막 모양을 보이나 성균으로 성장하면 깔때기 모 양으로 뒤집힌다. 갓의 크기는 4~10 cm, 갓 표면은 비로드 상이다 . 자루는 1~2 × 5~8 cm로 육질은 단단하고 조직은 치밀하다 (Fig. 3A). 자실체는 암갈색을 띠고 자루는 갓과 같은 황갈색 또는 암갈색을 띠며 속은 차 있다. 주름살은 약간 성글고 내린 주름이며 담갈색을 띤다. 황갈색 유액을 분비하며 상처 시 황갈색으로 변색한다(Fig. 3B). 담자기는 30~50 × 8~12 µm로 길쭉한 곤봉형이다(Fig. 3C, 3F) [4]. 포자는 4.5~6 × 5~6 µm이고 타원형 혹은 원형이며 철퇴 모양의 돌기들이 많다(Fig. 3D, 3E).
Fig. 3. Photographs and micrographs of Lactifluus ochrogalactus. A, B, Fruit bodies; C, F, Basidia; D, E, Spores. (scale bars: A, B = 2 cm).
Remarks: 한라산 해발 600~700 m, 관음사 및 산록도로 주변의 탐라계곡 인근에서 서식하며 주로 낙엽활엽수림 내 지상에서 단생하거나 군생한다. 노란색을 띠는 갈색 유액 이 특징적이며 본 종은 일본의 Hashiya에 의해 Lactarius ochrogalactus로 발표하였으나[14] Wang 등[15]에 의해 Lactifluus속으로 새로이 발표하였으며, 노란색을 띠는 갈색 latex와 pileipellis의 말단부가 두꺼운 벽으로 되어있다는 게 특징적이다[16].
Microstoma insititium (Berk. & M.A. Curtis) Boedijn [as ‘insititia’], Sydowia 5(3-6): 212 (1951)
Position in classification: Sarcoscyphaceae, Pezizales, Pezizomycetidae, Pezizomycetes, Ascomycota, Fungi. Synonym: Peziza insititia Berk. & M.A. Curtis 1860. Trichoscypha insititia (Berk. & M.A. Curtis) Cooke Peziza insititia Berk. & M.A. Curtis, Proc. Amer. Acad. Arts & Sci. 4: 127 (1860) Cookeina insititia (Berk. & M.A. Curtis) Kuntze, Revis. gen. pl. (Leipzig) 2: 849 (1891) Pilocratera insititia (Berk. & M.A. Curtis) Sacc. & Traverso, Syll. fung. (Abellini) 20: 412 (1911) BoedijnoPeziza insititia (Berk. & M.A. Curtis) S. Ito & S. Imai, Trans. Sapporo nat. Hist. Soc. 15: 58 (1937)
Habits & Habitats: 낙엽활엽수 아래 고사목에 자라며 (Uoukin-no-kai. 2001) 무리 짓는다. 주로 여름에서 초가을 에 매우 습한 곳에 발생한다.
Specimen examined: 제주도 거문오름에서 채집. RSNB NO: JUK08218. 2008. 10. 10
Morphological characteristic: 자실체는 자루가 달린 양주 잔 모양이며 자낭반의 지름은 8~12 mm이고 자실체 표면 은 유백색-담홍백색이며 건조하고 부드러운 고무질이며 분 질상이다(Fig. 4G). 자실체의 가장자리에만 속눈썹 모양의 백색 털이 나 있다(Fig. 4A, 4F). 자루의 길이는 5~15 mm 이고 굵기는 1~2 mm이며 유백색-담홍백색이고 겉은 매끄 럽다. 자루는 기부로 갈수록 가늘어진다(Fig. 4B).
Fig. 4. Photographs and micrographs of Microstoma insititium. A, B, Fruit bodies; C, E, Asci and paraphyses; D, H, Ascospores; F, Hair; G, Granule. (scale bars: A, B = 1 cm)
자낭은 8~10 × 400~500 µm로 길쭉한 막대형이다. 매우 고불고불한 측사를 가진다(Fig. 4C, 4E) [17]. 포자는 6~8 × 20~25 µm이고 길쭉하고 매끄러우며 양 끝은 뾰족한 모 양이다(Fig. 4D, 4H)
Remarks: M. insititium는 세계자연유산 거문오름 분화구 내에서 처음 채집된 후 동 발생지에서 해마다 큰 무리로 발 생하는 것으로 확인되었다. 특히 함몰지가 발달하여 습기 가 항상 많은 곳에 쓰러진 나무에서 대량으로 발생하였다. M. insititium은 거문오름 이외의 다른 서식처가 발견되지 않았다 . 자낭 사이에 측사는 가늘고 고불고불하며 작은 분 지들이 무수히 있다.
본 종은 Berkeley and Curtis에 의해 최초로 보고되었으 나[17] Boedijnopeziza 등의 속으로 혼동되어 사용되어 왔으 며, Harrington 등[18]의 연구에서 Cookeina는 Microstoma 속과 자매군으로 다뤄졌고 이는 이 두 속이 밀접하게 연관 되어 있다는 Korf의 관점을 확인시켰다[19]. Microstoma는 온대지방에 분포하고, Boedijnopeziza는 아시아에 분포하고 특징이 분명한 taxon으로 알려져 있으며 또는 Cookeina와 Synonym으로 다뤄지기도 한다[18]. Korf [19]는 Cookeina, Microstoma, Boedijnopeziza속을 위한 Tribe Boedijnopezizeae 제안했다. 이 속들은 apothecia에 있는 ascospores의 simultaneous maturation과 같은 특징들을 공유한다.
M. insititium에 대한 분류학적 지위에 대해서는 논쟁이 있어 왔다. 포자 모양, gel layer의 존재, 그리고 hairs의 origin과 유형은 M. insititium의 뚜렷이 구분되는 특징으로 보 여진다 . Harrington 등의 연구에서의 분자계통학적 데이터 는 이 종을 Cookeina 속으로 포함하는 것을 지지하고 있으 나 strict consensus tree의 충분치 못한 resolution으로 인 해 다른 taxa들과의 관계는 의문으로 남겼다[18].
현재까지 대부분 Cookeina속으로 분류되던 이 종은 gelatinous layer나 larger fusoid spores와 같은 Microstoma속 의 주된 특징을 가지고 있어 이 종을 Microstoma속으로 다 루는 것이 적절할 것으로 제안하였다[20].
Morchella semilibera DC., in Lamarck & de Candolle, Fl. franç., Edn 3 (Paris) 2: 212 (1805)
omycetidae, Pezizomycetes, Ascomycota, Fungi Synonym: Morchella semilibera DC., in Lamarck & de Candolle 1805 Morchella semilibera DC., in Lamarck & de Candolle, Fl. franç., Edn 3 (Paris) 2: 212 (1805) Mitrophora semilibera (DC.) Lév., Annls Sci. Nat., Bot., sér. 3 5: 249 (1846) f. semilibera Morilla semilibera (DC.) Quél., Enchir. fung. (Paris): 271 (1886) Morilla semilibera (DC.) Quél., Enchir. fung. (Paris): 271 (1886) var. semilibera Morchella patula var. semilibera (DC.) S. Imai, Science Rep. Yokohama Nat. Univ., Section 2 3: 15 (1954)
Habits & Habitats: 이른 봄 4월 하순에서 5월 초에 제주 조릿대 숲에서 채집되었다. 낙엽활엽수림 내 지상에서 단생하거나 소수가 군생하였다. 한국, 일본 등에 분포하며, 드물게 발생한다[13].
Specimen examined: 한라산 국립공원 어리목 탐방안내 소 진입로에서 채집. 해발 900 m, RSNB NO: JUK10074. 2010. 5. 2
Morphological characteristic: Morchella semilibera는 단 생하거나 소수가 모여 군생하며 두부의 크기는 2~3 × 2~3 cm로 전체 길이의 1/4~1/5 지점까지이며, 자실층은 황색갈황색이며 불규칙한 홈이 있다(Fig. 5A). 자루의 크기 및 굵기는 5~13 × 1.5~4 cm 이고 담갈색이며 자루의 가운데 는 비어있다(Fig. 5B). 자낭은 200~400 × 19~22 µm이다 (Fig. 5C) [21, 22]. 포자는 19~23 × 12~14 µm이고 타원형 이며 표면은 매끄럽다(Fig. 5D). 측사는 성숙하지 않은 자 낭 모양이다(Fig. 5C).
Fig. 5. Photographs and micrographs of Morchella semilibera. A, B, Fruit bodies; C, E, Asci and paraphyses; D, F, Ascospores. (scale bars: A, B = 2 cm)
Remarks: M. conica는 두부가 흑갈색이며, 길고 굵으며 자루는 상대적으로 짧고 가는 반면 M. semilibera의 경우 두부가 짧고 자루 길이의 절반 이하이다. M. esculenta는 두 부가 황색이고 두부에 비해 자루는 가늘고 대체적으로 짧 다 . Léveillé은 M. semilibera를 별개의 속인 Mitrophora Lev. 에 집어넣었으나[23], Mitrophora semilibera라는 학명은 지 난 세기동안 상대적으로 적게 사용되었다. 게다가, 멀티 유 전자 계통분석 연구는 M. semilibera가 Morchella의 Elata clade 안에 깊숙이 자리잡는다는 것을 보여주었다[24].
Morchella속은 true morel로 불리며 속이 빈 줄기에 의해 지지되는 독특한 이랑모양의 cap을 가지고 있다는 특징이 있다 . 반면 false morel의 줄기는 비어있지 않으며 솜 같은, 또는 단단한 조직으로 채워져 있는 점이 다르다[25].
DNA염기 서열 분석을 통한 재 동정
제주도에 자생하는 야생버섯 중에서 국내 미기록 종으로 추정되는 5종의 버섯에 대하여 DNA를 추출하고 염기서열 분석을 수행한 결과 표본 JUK13040은 Lactifluus ochrogalactus (Accession No.: GU258280)와 99% 상동성을 나타냈 고 유사종으로는 Lactarius leonardii로 96%의 유사성을 나 타냈다. 또한 표본 JUK08218은 Clavulina castaneipes (EU 669209.1)와 87%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.
하지만 그외 JUK13078, JUK10074, JUK13106 등 3종에 대해서는 건조된 시료의 크기가 작고 표본에 흙 등의 오염 원들이 묻은 것이 깨끗이 제거되지 않은 상태로 보관되어 있어서 현미경 상의 동정은 완료했으나 분자생물학적 동정 에는 실패하였다. 차후 새로운 표본이 채집되면 건조 전 깨 끗한 상태의 표본으로 분자생물학적 동정을 시도해야 할 것으로 생각된다.
적 요
본 연구에서는 제주도에서 채집된 야생버섯 표본 중에서 국내 미기록종으로 동정된 버섯 5종을 보고하고자 한다. 이들 버섯은 형태적 특징 및 미세구조를 관찰한 결과 Ramariopsis subtilis, Coltriciella pusilla, Lactifluus ochrogalactus, Microstoma insititium, Morchella semilibera로 동정되었다. 또한 Lactifluus ochrogalactus와 Microstoma insititia는 DNA 의 internal transcribed spacer (ITS) 염기서열 분석을 통하 여 재동정하였다.
