Diversity of Mycotoxigenic Fusarium armeniacum Isolated from Rice Grains at Harvest Time in Korea

벼 종자 채집 및 Fusarium 균 분리

2010년부터 2014년까지 5년간 벼 수확기에 8도 301지역 포장에서 509개 벼 이삭시료를 채집하였고, 각 시료 당 105개의 벼 종자를 1% sodium hypochlorite에 2분간 침지 하여 표면 소독하였다. 소독된 종자들은 살균수로 2회 세 척 후 멸균된 여과지로 물기를 제거한 다음 100개씩 streptomycin 600 µg/mL가 함유된 potato dextrose agar (PDA) 에 치상하였다. 25ºC 항온기에서 5일간 배양한 후 Fusarium 으로 예상되는 균총을 선발하여 PDA에 옮기고 포자가 형 성될 때까지 배양하였다. 포자현탁액을 물한천배지(water agar)에 도말한 다음 25ºC 항온기에서 12시간 배양 후 단 포자 분리를 실시하였다.

DNA 추출 및 염기서열 분석

분리된 Fusarium 균주를 대상으로 genomic DNA를 추 출하기 위해서 각 균주를 potato dextrose broth (PDB) 배 지에 접종하고, 25ºC에서 5~7일간 정치 배양하였다. 배양 된 균사체를 miracloth로 수거하고 동결건조하여 마쇄한 후 acetyltrimethylammonium bromide (CTAB)-phenol/chloroform 추출법[7]으로 genomic DNA를 추출하고, -20ºC에 보관하면서 실험에 사용하였다. Translation elongation factor 1-α (EF-1α) 유전자의 염기서열 분석을 위하여 O'Donnell 등[8]의 방법에 따라, 5´-ATGGGTAAGGAA GACAA GAC-3´(EF-1)과 5´-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3´ (EF-2) 프라이머를 사용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 실시하였다. PCR 반응액은 100 ng/µL의 template DNA를 포함하여 1× Taq buffer, 2 mM dNTPs, 10 pmole 의 양방향 primer쌍, 0.5 unit의 Taq DNA polymerase를 총량 50 µL로 제조하였다. PCR 증폭은 94ºC에서 30초, 50 ºC에서 30초, 72ºC에서 90초를 35회 반복하였고, 최종적으 로 72ºC에서 7분간 post extension을 실시하였다. 증폭산물 은 QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Germantown, MD, USA)를 사용하여 정제한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 GenBank (accession no. KT223045-22 3047 및 KT339744-KT339764)에 등록하였고, Genbank 및 FUSARIUM-ID (http://isolate.fusariumdb.org/index.php)에 보관된 염기서열과 상동성을 분석하였다. Clustal W 소프 트웨어 [9]를 이용하여 염기서열을 정렬하였고, 계통수는 MEGA 6.0 프로그램을 사용하여 neighbor-joining법으로 작성하였다.

균학적 특성조사

염기서열에 의해 동정된 F. armeniacum의 배양적 특성 은 PDA에서 조사하였다. 먼저 균주를 직경 5 mm의 cork borer로 잘라 PDA 배지 중앙에 접종한 후, 7일간 25ºC 암 조건에서 배양한 후 균사생장을 조사하였고, 균총의 모양 과 색, 색소 형성의 유무 등을 14일 후 조사하였다. 형태적 특성은 Leslie와 Summerell [10]의 방법으로 조제된 carnation leaf agar (CLA) 배지에서 조사되었다. 준비된 배지에 5 mm cork borer로 자른 균총을 치상하고 near ultra violet (NUV)를 12시간/1일으로 조사되는 25ºC 항온기에서 2 주 배양한 후 대형분생포자의 모양과 크기, 소형분생포자 의 형성 유무, 모양 및 크기, 후막포자의 형성 유무 등 형태 적 특성을 조사하였다.

T-2 및 HT-2 독소의 정량분석

Potato sucrose agar(감자 200 g, sucrose 20 g, 증류수 1,000 mL) 배지에 공시 균주를 접종하고 20ºC 암 상태에서 2주간 배양하였다. 250 mL 삼각플라스크에 배양 배지를 넣고 acetonitrile (ACN)을 g당 5 mL씩 첨가한 다음 1시 간 동안 진탕 추출하고, 여과지(Whatman No. 1; SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA)로 여과하였다. 여과액은 1/5 로 희석하여 immunoaffinity column (IAC)을 통과시킨 다 음 3차 증류수 10 mL로 세척하고, ACN을 500 µL 씩 3회 총 1.5 mL를 통과시켜 용출시켰다. 여과액은 질소건조시킨 후 50% 메탄올 1 mL에 녹여 분석에 사용하였다. LC/MS를 이용한 독소의 분석을 위해서 Waters alliance e2695 separation module (Waters, Milford, MA, USA)과 Waters 3100 mass detector를 사용하였고, 컬럼은 Zorbax SB-Aq (3.0 × 150 mm, 5 µm)를 사용하였다. 컬럼의 온도는 40ºC, 주입 량은 5 µL, 이동상 유속은 0.3 mL/min, 용매조성은 5 mM ammonium acetate를 첨가한 증류수와 ACN을 70:30으로 4분 동안 둔 다음, 7분까지 ACN을 85%로 증가시켜 6분 동 안 유지시켰고, 이어 초기상태의 용매조성으로 감소시킨 후 2.5분동안 유지시켰다. 질량분석기의 검출조건은 Table 1과 같다. capillary는 2,500 V, source 온도는 150ºC, 탈용매 화 온도는 450ºC였고, 콘 가스 유량은 100 L/hr, 탈용매화 가스 유량은 600 L/hr이었다. LC/MS의 자료분석은 Mass Lynx 4.1 (Waters) 프로그램을 사용하였다.

Table 1. Parameter for the mass spectrometric detection of mycotoxins

Table 2. Occurrence of Fusarium armeniacum from rice grains collected at harvest time from 2010 to 2014 in Korea

균분리 및 분자생물학적 F. armeniacum 동정

2010년부터 2014년까지 5년간 전국 8도의 301개 지역, 509개의 벼 이삭시료에서 총 6,658개의 Fusarium속 균주 가 분리되었다. 분리된 균주에 대하여 EF-1α 유전자의 염 기서열을 분석한 결과, 경북을 제외한 전국 7도 26지역, 29시료로부터 67균주가 F. armeniacum으로 동정되었다 (Table 2). F. armeniacum의 분리빈도를 조사한 결과, 2010 년 0.7%, 2011년에는 균이 분리되지 않았고, 2012년 1.8%, 2013년 1.4%, 2014년 0.4%로서 해마다 다소 차이가 있었 으나 대개 1% 이하의 낮은 검출율을 나타냈다. 전 세계적 으로 벼를 포함하여 보리, 밀 등 곡류에서 독소생성 Fusarium균으로는 붉은곰팡이병을 일으키는 F. graminearum종 복합체(FGSC)가 잘 알려져 있다[3]. FGSC는 식물병원균 으로서 매년 빈번하게 발생하면서 수량과 품질을 저하시킬 뿐만 아니라, B형 trichothecene, ZEA 등과 같은 독소를 생 산하는 주요한 생물적 위해 인자로 알려진 반면, F. armeniacum은 미국, 아프리카, 호주, 일본 등에서 매우 낮은 빈 도로 발견되며, 호주에서는 수해를 입은 밀의 지제부와 낟 알 및 토양, 남아프리카에서는 여섯줄보리와 귀리의 낟알 및 토양, 미국에서는 병징이 없는 옥수수 및 페스큐 건초, 일본에서는 금잔디에서 보고되었다[11, 12]. 또한, 미국에 서는 콩뿌리썩음병[13], 중국의 도라지에서는 줄기 및 뿌리 썩음병을 일으키는 식물병원균으로서 보고되었으나[14] 벼 에서는 식물병원균이나 부생균으로도 보고된 바 없다. 그 동안 F. armeniacum은 낮은 분리빈도 때문에 다른 진균독 소생성 Fusarium종에 비해 크게 주목을 받지 못했으나 T-2 와 HT-2 독소를 생성하는 Fusarium 종 중 하나로서 습한 지역이나 주기적인 침수지역과 강우가 많은 해에는 토양 에서 빈번하게 분리되는 것으로 알려져 왔다[11, 12]. 비록 심하게 오염되지는 않았지만 국내산 현미에서 이미 T-2와 HT-2 독소오염이 보고된 바 있고[5] 본 연구에서 F. armeniacum이 벼로부터 분리되었기 때문에 국내 벼 재배에서 F. armeniacum에 의한 T-2와 HT-2 독소오염은 가능한 시 나리오로 생각된다. 다만, 이 균에 대한 이전의 연구로 볼 때 독소오염은 매년 빈번하게 발생하는 것이 아니라 수확 기에 지속적인 강우로 다습한 조건이 형성되어 토양 내 균 밀도가 증가하고, 태풍 등에 의한 벼의 도복으로 토양에서 이삭으로 균이 오염되는 환경하에서 심하게 발생할 가능 성이 높다.

F. armeniacum의 유전적 다양성

EF-1α 유전자의 염기서열을 기초로 F. armeniacum으로 동정된 국내 24균주와 형태적으로 유사한 종으로 알려진 Fusarium acuminatum 및 염기서열의 상동성이 높은 Fusarium 종들과 함께 계통수를 작성하였다(Fig. 1). 국내 균주 는 98% 이상의 높은 bootstrap값에 의해 3개의 group으로 구분되었다. Group 1은 F. armeniacum의 type strain (FRC R-9335), 미국 수수잎(H02-781L-5B), 일본 금잔디(MAFF 236716), 호주의 토양(NRRL31970)에서 분리된 균주가 포 함되었고, 국내 24균주 중 충남 태안, 공주, 부여, 경남 함 안 , 밀양, 김해 및 강원 인제에서 분리된 총 16균주(67%)가 포함되어 가장 큰 group을 형성하였다. Group 2는 충남 태 안 2균주(10Rhcnta5-15-W4, 10Rhcnta8-4-R6)와 공주 2균 주(10Rhcngj1-W2, 10Rhcngj1-R5W) 및 경남 밀양에서 분 리된 2균주(13RhGn04-3-1, 13RhGn04-10)를 합하여 총 6 균주 (25%)를 포함하였고, 외국 균주는 포함되지 않았다. Group 3은 동물병원균으로 미국 말의 눈에서 분리된 균주 (NRRL 43641)와 미국 페스큐 건초에서 분리된 균주(NRRL 6227)가 포함되었고, 국내 균주로는 충남 태안에서 분리된 2균주(10Rhcnta8-7-P1, 10Rhcnta8-4-Y21; 8%)를 포함하 였다.

F. armeniacum은 1983년 미국의 옥수수에서 F. acuminatum의 비전형적인 균주로서 처음 인식되었고, 1993년 분생 포자의 모양과 크기, 균총형태, 생장율을 기초로 F. acuminatum의 아종 중 하나인 F. acuminatum subsp. armeniacum으로 기술되었으며, 2000년 독소생성, 핵형, isozyme 및 RAPD 분석을 이용한 유전적 관련성을 기초로 F. acuminatum과는 구분되는 종으로 확립되었다[11, 12, 15, 16]. 이와 같이 F. armeniacum과 F. acuminatum을 구분하기 위 한 분류학적 비교 연구는 이전부터 이루어져 왔으나[11, 12, 15] F. armeniacum의 종내 개체군에 대한 유전적 다양 성 연구는 이루어진 바 없다. 본 연구결과는 F. armeniacum 이 유전적으로 적어도 3개의 그룹으로 구분되며, 종내 다양 성이 존재한다는 것을 제시한다. 전 세계적으로 F. armeniacum의 종내 유전적 다양성 연구는 아직까지 매우 미흡한 실정이므로 많은 국내·외 균주를 대상으로 multilocus sequence typing (MLST)을 이용한 연구가 필요할 것으로 생 각된다.

Fig. 1. A neighbor-joining tree derived from sequences of translation elongation factor 1α region of Fusarium armeniacum. Numbers on nodes (> 60%) represent bootstrap values (%) from 1,000 replicates. A phylogenetic tree was conducted using MEGA 6.0 with neighbor-joining method. The letters in parentheses refer to isolate numbers. Bar represents 0.02 substitutions per site (scale bar = 0.02).

형태적, 배양적 특성 및 독소생성

PDA 배지에서 F. armeniacum은 초기에는 백색의 풍부한 기중균사체가 형성되며, 배양시간이 경과하면서 대부분의 균주는 분홍색을 띤 백색을 나타내지만(Fig. 2A) 일부 균주 는 노랑색을 띤 백색이나 연갈색이었고(Fig. 2C), 배지의 뒷면은 황적색(Fig. 2B)이나 황백색(Fig. 2D)을 나타냈다. 균총생육은 균주에 따라서 다소 달랐지만 대개 접종 7일 후 80 mm 이상으로 빠르게 생장하였다(Table 4). CLA 배 지에서 대형분생포자는 살구색-연황색 분생포자퇴(sporodochia) (Fig. 2E)의 분지된 분생자경의 단경자(monophialide)에서 풍부하게 형성되었다(Fig. 2F). 대형분생포자는 길고 , 낫 모양(falcate), 벽은 두껍고, 3~7개의 격벽이 있었 다. 대개 3~5개의 격벽을 갖는 10Rhcnta8-4-Y21(Fig. 2G) 균주는 분생포자의 크기가 3.0~4.5 × 28.4~55.5 µm로서 문 헌상에서 기술된 F. acuminatum의 분생포자 크기(2.8~4.2 × 30.0~55.7 µm) [11]와 유사하였고, 5~6개 혹은 드물게 7 개의 격벽을 갖는 14RRCn0701-P3균주(Fig. 2H)는 분생포 자의 크기가 3.6~4.8 × 37.3~91.2 µm (평균 4.1× 68.5 µm) 로서 격벽의 수와 분생포자의 크기는 상호연관성이 있었다. 정단세포는 길고, 굽어있고, 점차 가늘어지며, 기부세포는 뚜렷한 foot 모양이었다. 분생포자퇴에서 형성된 분생포자 의 크기는 균주에 따라서 크게 다르지만 2.9~4.9 × 25.0~ 91.2 µm의 범주 내에 있었고, 소형분생포자는 관찰되지 않 았다 (Table 3). 후막포자는 균사 내에서 초기에는 투명하나 점차 연갈색을 나타내며, 단독, 쌍, 사슬 혹은 덩어리로 풍 부하게 형성되었다(Fig. 2I, 2J). 비록 일부 F. armeniacum 균주의 포자크기는 F. acuminatum의 포자크기와 유사하였 지만 균주들의 다른 형태적, 배양적 특성은 Burgess 등[11] 에 의해 기술된 F. armeniacum과 비교적 잘 일치하였다 (Table 3).

Fig. 2. Morphological features of Fusarium armeniacum. A~D, Front (A and C) and reverse (B and D) of colony on potato dextrose agar; E, Pale orange sporodochia on carnation leaf agar; F, Branched conidiophores with monophialides; G, H, Macroconidia produced in sporodochia; I, J, Chylamydospores. (scale bars: A~D = 10 µm, E = 300 µm, F~J = 10 µm)

Table 3. Comparison of morphological characteristics of Fusarium armeniacum isolated from rice grains

^aBurgess et al. [11]

공시된 24균주에 대하여 T-2와 HT-2 독소생성을 조사하 였던 바, 태안에서 분리된 2균주(10Rhcnta5-2-R1, 10Rhcn ta8-7-P1)와 밀양에서 분리된 1균주(13RhGn04-3-1)를 제 외하고 21균주에서 두 가지의 독소를 모두 형성하였고, 독 소생성량은 균주에 따라서 다양하게 나타났다(Table 4). T2 독소는 밀양 13RhGn04-5균주에서 최소 1 ppm부터 밀양 13RhGn04-6균주에서 최대 100.5 ppm까지 생산되었고, HT2 독소는 태안 10Rhcnta8-9-W1균주에서 최소 6.0 ppm부터 인제 10RhGWR9W3균주에서 최대 229 ppm까지 생성 되었다. 독소생성이 없는 3균주는 Fig. 2의 유전적으로 구 분된 F. armeniacum 종내 group 1, 2, 3에 각각 분포하고 있어서 특정 유전적 group과 독소생성과의 연관성은 없는 것으로 나타났다.

Table 4. Fusarium armeniacum isolates used in this study along with geographical origin, cultural characteristics and toxin production

PW, pinkish white; YR, yellowish red; YW, yellowish white; LB, light brown; B, brown; RP, red pink; BW, brownish white; P, pink; RB, red brown; DY, dull yellow; PP, pale pink; PB, pale brown; W, white; PY, pale yellow; DO, dull orange; RY, reddish yellow.

이상의 결과로부터 수확기 벼 이삭에서 분리된 국내산 F.armeniacum 균주의 대부분이 potato sucrose agar (PSA) 배 지에서 T-2와 HT-2 독소를 생성한다는 것을 확인하였다. 각종 곡류에서 F. sporotrichioides, F. langtheciae, F. armeniacum 등 다양한 Fusarium 종에 의한 T-2와 HT-2 독소 오염이 보고되었으나[16, 17], 국내의 주곡작물인 벼에서 T-2와 HT-2 독소를 생성하는 F. armeniacum에 대한 보고 는 처음이다. 앞으로 수확 전 벼 포장에서 강한 독성을 갖 는 T-2와 HT-2 독소저감을 위하여 F. armeniacum에 대한 발생환경, 감염시기, 감염경로, 병원성 등 생태학적, 병원 학적 연구가 필요할 것으로 생각된다.