서론
버섯은 진균류의 일종으로 담자포자를 형성하는 담자균 류에 주로 분포하고 있고 탄수화물 외에도 단백질과 핵산 등이 풍부하며 특히 β-glucan과 provitamin D인 ergosterol 을 함유하고 있어 생식 외에도 건강소재 자원으로 많이 사 용되고 있다[1, 2].
버섯의 주요 약리 효과로는 오래 전부터 영지버섯(Ganoderma lucidum)을 중심으로 많은 연구가 진행되어 왔고 주요 약리효능으로는 영지버섯의 콜레스테롤 저해효과[3] 와 흰목이버섯(Tremella fuciformis)의 혈당상승 억제작용 [4], 동충하초(Cordyceps sinensis)의 혈당 강하효과[5], 좀 나무싸리버섯(Clavicorona pyxidata)의 항균작용[1], 왕송 이버섯(Tricholoma giganteum)의 항암작용[6], 일반 식용 버섯류의 혈소판 응집 저해효과와 혈전용해효과[7], 항산 화 작용과 정력증강 작용[8] 등이 보고되어 있다. 또한 최 근에 Lee 등[9]은 왕송이버섯에서, Koo 등[10]과 Jang 등 [11]은 각각 검은비늘버섯(Pholiota adiposa)과 노랑느타리 버섯(Pleurotus cornucopiae)에서 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 저해 물질의 추출 및 특성을 보고하였다.
한편, 잣버섯(Neolentinus lepideus)은 담자균류 주름버섯 목 구멍장이버섯과 잣버섯속의 버섯으로[12], 한국, 일본, 유럽에 주로 분포하며, 초여름부터 가을에 걸쳐 침엽수 또 는 소나무의 죽은 가지 혹은 그루터기에 홀로 자라거나 무 리 지어 생육하는 갈색부후균 중의 하나이다.
지금까지 잣버섯의 생리기능성에 관한 연구로는 Jin 등 [13-15]의 항암 및 항고혈압효과, 간 기능개선효과, 항세균 효과와 면역증진효과, Yoon 등[16]의 고지혈증 예방효과와 항산화활성 등이 보고되었다. 또한 최근 잣버섯의 영양성 분과 항산화활성 등이 보고되었고[12], ergosterol [17]과 gallic acid 등의 다양한 페놀화합물 등이 보고되었다. 아울 러 잣버섯이 가진 우수한 향미와 식감으로 고급 식재료 자 원으로 이용되기 시작하여 이들의 대량생산을 위한 생육온 도와 재배방법 등에 따른 생육특성[18-20] 등이 연구, 보고 되었다. 그러나 아직까지 잣버섯 자실체의 α-glucosidase 저해제와 실험동물을 이용한 이들의 혈당상승 억제 효과에 관한 연구는 실시되지 않았다.
따라서 본 연구에서는 버섯류로부터 건강기능성 식품소 재 개발 연구의 일환으로 먼저 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 노랑느타리버섯(Pleurotus cornucopiae), 분홍느타리 버섯(Pleurotus salmoneostramineus)과 새송이버섯(Pleurotus eryngii), 잣버섯(Neolentinus lepideus)들 물 추출물과 에 탄올 추출물을 제조한 후 이들의 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다. 이들 가운데 활성이 가장 우수하였던 잣버섯 에탄올 추출물에 함유되어있는 α-glucosidase 저해물질의 추출최적조건을 검토하였고 일반 쥐와 이들을 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 당뇨 쥐로 구분하여 잣버섯 에 탄올 추출물의 혈당상승 억제 효과를 검증하였다.
재료 및 방법
실험재료
시료 버섯은 경기도 농업기술원 버섯연구소로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside( p-NPG)와 α-glucosidase 및 당뇨유발물질 streptozotocin들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였고 기타 시약은 분석용 특급을 사용하였다.
또한 혈당상승 억제효과 검증에는 Sprague-Dawley (SD) 수컷 흰쥐를 대한바이오링크(Eumseong-gun, Korea)에서 구입하여 사용하였고 이들의 사육에는 Kim 등[21]에서와 같이 마우스 렛 전용사료를 사용하여 사육하였다.
α-Glucosidase 저해활성 측정
α-Glucosidase 저해활성은 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8) 에 0.1 U/mL의 농도로 조정한 표준 α-glucosidase 효소액 50 μL와 시료 50 μL를 96-well plate에 넣고 37ºC에서 5분 간 반응시킨 후 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8)으로 2 mM 로 희석한 기질 p-NPG 용액 50 μL를 첨가한 후 37ºC에서 25분간 반응시켰다. 여기에 0.1 M sodium carbonate를 100 μL 넣어 반응을 정지시킨 후 ELISA (Tecan, SanJose, CA, USA) 측정기로 405 nm에서 p-nitrophenol 함량을 측 정하여 다음과 같이 저해활성을 계산하였다[21].
α-Glucosidase 저해활성(%) = (C − T) / C × 100
(C: 대조구의 p-nitrophenol 함량, T: 시료첨가 후 생성 된 p-nitrophenol 함량)
동물실험
일반 쥐를 이용한 혈당상승 억제 효능 검증 실험은 실험 동물의 사육에 관한 배재대학교 동물실험윤리위원회의 가 이드라인(등록번호: 2014 pcu-001)을 준수하여 다음과 같 이 실시하였다.
먼저 생후 6주령(180~200 g)된 수컷 쥐를 온도 22 ± 1ºC, 습도 55 ± 7%, 낮밤주기 12시간으로 유지되는 동물 사육실 에서 매일 15~20 g 마우스 렛 전용사료와 물을 주면서 1주 일간 적응시켰다[22, 23].
이들 실험동물을 무작위로 일반 쥐와 당뇨 쥐로 구분하 고 다시 이를 무처리 대조군과 시료첨가 실험군으로 나누 었다. 당뇨 유발은 공복상태의 쥐에 0.1 M citrate buffer (pH 4.5)에 용해시킨 streptozotocin (STZ, 60 mg/kg)를 1 회 복강주사한 다음 3일 후 혈당측정기(Accu-Chek Active; Roche, Indianapolis, IN, USA)로 혈당함량을 측정하여 혈 당치가 300 mg/dL 이상인 쥐만을 선발하여 당뇨 쥐로 실 험에 사용하였다.
혈당상승 억제 효능 검증은 이들 일반 쥐와 당뇨 쥐들을 대조군과 실험군 및 비교군으로 각각 구분하여 실시하였다. 먼저 대조군에는 멸균수를 투여하고 실험군에는 동결건조 한 잣버섯 추출물을 500 mg/kg, 1000 mg/kg의 농도로 경 구 투여하였으며 비교군으로 시판 혈당상승 억제제인 acarbose (Glucobay Tab. 50mg; Bayer Korea, Seoul, Korea)를 15 mg/kg를 경구 투여하여 실시하였고 glucose를 3 g/kg로 투여한 후 시간 별로 혈당을 측정하여 투여 120분까지 혈 당상승 억제 정도를 측정하였다. 혈중 포도당 함량은 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하고 혈당측정기로 측정하였다[24- 26].
결과 및 고찰
α-Glucosidase 저해활성 우수 버섯 선발
경기도 버섯연구소로부터 분양 받은 느타리버섯 등 5종 의 버섯 분말들을 30ºC에서 24시간 distilled water (D.W) 와 95% 에탄올로 각각 추출한 후 이들 추출물들을 동결건 조하여 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다.
Table 1과 같이 잣버섯 자실체를 95% 에탄올로 24시간 추출한 추출물이 86.3%으로 가장 높은 α-glucosidase 저해 활성을 보여 최종 혈당상승 억제 물질 함유 우수 버섯으로 잣버섯을 선정하였다.
한편 물 추출물에서는 노랑느타리버섯 자실체를 30ºC에 서 24시간 동안 증류수로 추출한 추출물의 α-glucosidase 저해활성이 48.5%로 가장 높았고 분홍느타리버섯도 39.1% 의 저해활성을 보였다.
잣버섯 α-glucosidase 저해물질의 추출 조건
95% 에탄올을 이용하여 잣버섯 자실체중의 α-glucosidase 저해물질 대량 추출을 위한 추출 시간의 영향을 검토 한 결과, 추출 시간이 길어짐에 따라 저해활성이 증가하여 추출 48시간 후에 얻은 추출물의 α-glucosidase 저해활성이 88.9%를 보여 가장 높았고 24시간 추출물에서도 86.0%의 저해활성을 보였다(Table 2).
또한 추출온도의 영향을 조사한 결과 30ºC에서 48시간 추출하였을 때 가장 높은 88.2%의 저해활성을 보였고 20ºC 추출에서도 85.2%로 비교적 높은 저해활성을 보였으나 40 ºC와 50ºC에서 추출에서는 각각 64.8%와 45.1%로 활성이 급격히 낮아졌다(자료미제시). 이들 결과로 보아 잣버섯 자 실체에 함유되어있는 α-glucosidase 저해물질은 95% 에탄 올로 20~30ºC에서 48시간 추출했을 때 대부분 추출되는 것 으로 추정되었고 40ºC 이상 추출시 활성이 급격히 낮아지 는 것으로 보아 잣버섯에 함유되어있는 혈당상승 억제성 α-glucosidase 저해물질은 열에 약한 단백질이나 펩타이드 계통의 물질 등으로 생각된다. 한편 Kim [29]은 커피 중의 α-glucosidase저해제가 β-carboline alkaloid norharman이 었음을 보고하였다.
일반 쥐와 당뇨 쥐에서의 혈당상승 억제 효과
일반 쥐에서 잣버섯 추출물의 혈당상승 억제 효과를 조 사하기 위해 먼저 포도당을 3 g/kg으로 투여하고 다시 혈당 상승 억제성 α-glucosidase 저해물질을 함유한 잣버섯 에 탄올 추출물의 동결건조 분말을 500 mg/kg, 1000 mg/kg의 농도로 경구 투여 후 120분까지 투여 시간에 따른 혈중 포 도당 함량의 변화를 측정하였다(Fig. 1).
투여 전 평균 혈중 포도당 함량이 92 ± 5 mg/dL이었던 일 반 쥐들에게 증류수를 경구 투여한 대조군의 쥐에서는 투 여10분 후 혈중 포도당 함량이 195 ± 9 mg/dL로 급격히 증 가하였다가 점점 낮아져 120분 후에는 108 mg/dL의 혈중 포도당 함량을 보였다. 이에 비하여 α-glucosidase 저해물 질을 함유한 잣버섯의 에탄올 추출물을 500 mg/kg과 1000 mg/kg 투여한 일반 쥐들에서는 투여 10분 후 각각 197 ± 6 mg/dL, 194 ± 6 mg/dL의 혈중 포도당 함량을 나타내어 무 처리 대조군과 비슷하였으나 시간이 경과함에 따라 점점 낮아져 투여 120분후에는 98 mg/dL와 90 mg/dL로 무처리 대조군보다 낮은 함량을 보여 혈당상승 억제 효과를 확인 하였다.
Fig. 1. Changes of blood glucose levels up to 120 minute after administration of 3 g/kg glucose and various concentration of ethanol extract from Neolentinus lepideus in normal SD-rat (D.W., distilled water, SD, Sprague Dawley).
또한 시판 혈당상승 억제제인 acarbose를 15 mg/kg의 농 도로 일반 쥐에 경구 투여 하였을 때 역시 투여 10분 후 혈 액중의 포도당 함량은 잣버섯 추출물 처리군보다 낮은 187 ± 6 mg/dL를 보였고 시간이 경과함에 따라 점점 낮아 져 120분 후에는 85 mg/dL의 포도당 함량을 보였다. 한편 α-glucosidase 저해물질을 함유한 잣버섯의 에탄올 추출물을 이용하여 streptozotocin로 당뇨를 유발시킨 당뇨 쥐에서 혈당상승 억제 효능을 조사하였다(Fig. 2).
Fig. 2. Changes of blood glucose levels up to 120 minute after administration of 3 g/kg glucose and various concentration of ethanol extract from Neolentinus lepideus in streptozotocin-induced diabetic SD-rat (D.W., distilled water, SD, Sprague Dawley).
투여 전 320 ± 9 mg/dL의 평균 포도당 함량을 보였던 당 뇨 쥐에 증류수를 투여한 대조군의 혈중 포도당 함량은 30 분 후에 591 ± 12 mg/dL로 급격히 증가한 후 시간이 경과 함에 따라 점점 낮아지는 경향을 보여, 120분 후 458 ± 5 mg/dL의 혈중 포도당 함량을 보였다. 이에 비하여 일반 쥐 에서와 같이 잣버섯의 에탄올 추출물을 500 mg/kg, 1,000 mg/kg의 농도로 투여한 당뇨 쥐들에서는 투여 30분 후 각 각 568 ± 8 mg/dL, 588 ± 11 mg/dL의 혈중 포도당 함량을 보여 대조군보다 포도당 함량이 낮아 혈당 상승이 억제됨 을 알 수 있었고 이후 투여시간이 경과함에 따라 점점 낮 아지다가 120분 후에는 각각 403 mg/dL와 388 mg/dL의 혈당함량을 보여 대조군의 혈당 함량보다 55~70 mg/dL 낮은 함량을 보였다.
또한 시판 혈당상승 억제제인 acarbose를 15 mg/kg의 농 도로 경구 투여하였을 때 30분 후 502 ± 11 mg/dL 혈중 포도당 함량을 보였고, 시간이 지나면서 점점 혈중 포도당 함량이 낮아졌다.
이상의 결과들을 종합하였을 때 잣버섯 에탄올 추출물은 시판 혈당제인 acarbose 만큼의 큰 효과가 아니지만 일반 쥐와 당뇨 쥐 모두에서 식후 혈당상승 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 비록 본 연구의 잣버섯 자실체 분말의 30ºC 에탄올 추출물이 인체 내에서의 단기 혈압상승 억제효과 를 기대하기 위해서는 추출물의 수율(38%)을 감안하였을 때 대량 섭취의 어려움이 있겠지만 이들을 이용한 건강소 재 또는 음료 등의 개발에는 매우 유용한 자료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
한편 Park 등[26]은 streptozotocin-nicotinamide로 유도 된 제2형 당뇨모델 쥐에 조각자(Gleditschiae Spina) 추출물 을 10주까지 장기투여 했을 때 혈당상승 억제 효과가 있음 을 보고하였다.
실험 쥐들의 혈액 중의 생화학 성분
일반쥐와 당뇨 쥐들의 경구투여 120분 후의 혈액을 채취 하여 주요 생화학 성분을 분석하였다(Table 3).
Table 3. Biochemical components of plasma from SD-rats and diabetic-rat in 120 minute after administration of Neolentinus lepideus ethanol extracts
Diabetic-rat from treatment by streptozotocin; SD-rat and diabetic-rat after administration of Neolentinus lepideus 95% ethanol extract. SD, Sprague Dawley.
먼저 일반 쥐에서 잣버섯 추출물 투여군과 대조군 간에 creatinine, urea, Fe 함량, alkaline phosphatase 활성 등은 큰 차이가 없었으나 cholesterol 함량은 잣버섯 추출물 투여 구에서 약 15~20 mg/dL 낮았다.
또한 당뇨 쥐에서는 alkaline phosphatase 활성과 cholesterol 함량은 약 40% 이상 낮아졌으며, HDL-cholesterol 함량은 약 4배 이상 증가하여 이들 잣버섯 추출물이 혈당 상승 억제 효과 외에 간기능 개선에도 효과가 있는 것으로 추정되었다. 그러나 잣버섯 추출물의 투여량을 500 mg/kg 과 1,000 mg/kg으로 달리하였을 때 혈액의 생화학적 성분 에는 큰 차이가 없었다.
적 요
버섯을 이용하여 새로운 혈당상승 억제 물질을 개발하여 건강 기능성 식품 소재 산업에 응용하고자 느타리버섯, 노 랑느타리버섯, 분홍느타리버섯, 새송이버섯과 잣버섯들의 α-glucosidase 저해활성을 측정한 결과 잣버섯 자실체의 에 탄올 추출물이 가장 높은 α-glucosidase 저해활성을 보였다. 잣버섯 자실체 분말을 95% 에탄올로 30ºC에서48시간 추출 하였을 때 α-glucosidase 저해물질이 가장 많이 추출되었고 이 α-glucosidase 저해물질을 함유한 잣버섯 에탄올 추출물 은 일반 쥐와 streptozotocin으로 당뇨를 유발시킨 당뇨 쥐 에서 모두 농도 의존적으로 식후 혈당상승 억제 효과를 보 였다.
