서론
토마토에 발생하는 풋마름병은 병원균이 Ralstonia solanacearum로서 열대, 아열대, 온대 기후지역에 널리 분포하 여 가지과작물인 고추, 가지, 감자, 담배 등 50과 400종의 많은 작물의 생산에 심각한 피해를 주는 식물 병원세균이 다[1-3].
이 병원균은 토양에 존재하는 토양전염성으로 식물 뿌리 의 열린 개구나 상처를 통하여 식물체 내부에 침입하여 물 관에 도달한 병원세균은 세균 표면에 존재하는 당지질이나 섬모를 이용하여 물관벽에 부착하여 발병을 시작한다[4-7]. 토마토 풋마름병이 발생한 포장에서 병든 그루는 푸르게 시들고 도관부에 갈변되어 있으며 뿌리의 길이가 건전주 보다 짧으며 또한 갈변되어 결국 식물체가 말라 죽는다 [8].
시설재배에 따른 연작으로 많은 농가에서 풋마름병에 의 한 피해를 겪고 있으며, 이를 해결하기 위해 토양환경 개선, 토양소독, 비기주작물이나 녹비작물을 재배하거나 저항성 품종 육종, 길항미생물 활용, 저항성대목을 이용한 접목묘 를 이용하여 예방적 차원에 연구와 더불어 방제가 이루어 지고 있으나 매우 방제하기가 어렵다[9-14]. 그리고 토마 토 풋마름병 방제에 화학약제의 사용은 오남용에 따른 약 해, 약제내성 및 환경오염 우려가 있어 효과적인 친환경 방 제제 개발이 필요하다.
최근 국내에서 버섯은 수요자 요구의 증가로 병재배나 봉지재배 면적이 증가됨에 따라서 버섯 수확후 배지가 연 간 200만톤 이상으로 추정된다[15]. 담자균 204종 317균주 가 인체 병원 세균과 곰팡이에 대하여 항균활성이 있음을 보고한 바 있다[16]. 버섯 수확후 배지는 항균물질, 병 저 항성, β-glucosidase, cellulase 등의 다양한 효소, 식물생육 촉진 등과 관련한 이차대사산물이 포함되어 있는 것으로 알려져 있어[17-20], 특히 식용버섯의 수확후 배지의 물질 을 추출하여 식물 병을 친환경적으로 방제에 활용할 수 있 을 것으로 생각된다[15, 19, 21, 22].
따라서 본 연구에서는 노루궁뎅이버섯 수확후 배지를 효 과적으로 활용하고 환경친화적 안전 농산물을 생산하기 위 하여 토마토에 발생하는 주요 병원균에 대한 억제 효과와 토마토 풋마름병에 대한 방제 효과 검정을 실시하였다.
재료 및 방법
시험 미생물 보관
국립농업과학원 농업미생물과에 보존되어 있는 토마토에 발생하는 식물병원곰팡이균 Alternaria solani, Botrytis cinerea, Corynespora cassicola, Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Rhizoctonia solani, Sclerotinia slcerotiorum 7균주는 10oC 항온기에 사면배지로 보관하였으며, 토마토 풋마름병균 Ralstonia solanacearum 1401과 1402 균주는 -73oC 초저온냉동고에 보관하면서 사용하였다.
노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물의 토마토 식물병원곰 팡이에 대한 항균활성 검정
식물병원균 Alternaria solani, Botrytis cinerea 등 7균주 를 potato dextrose agar (PDA) 배지에 이식 후 25oC에서 7일간 배양하여 저지원 검정하였다. 검정방법은 노루궁뎅 이버섯 수확후 배지와 물을 1:1의 비율로 2시간 추출하고, 거즈를 이용하여 거른 뒤 추출액을 8,000 rpm, 4oC에서 15분간 원심 분리 후 고압 멸균하여 사용하였다. 수확후 배 지 추출물을 1/2 PDA와 수확후 배지 추출물을 각각의 희 석배수별로 혼합하여 분주 후 직경 5 mm 코르크보러를 이 용하여 병원균의 균총을 일회용 페트리디쉬 중앙에 치상 하여 25oC 항온기에서 7일간 배양 후 균총직경을 조사하 였다[15].
노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물의 토마토 풋마름병균 에 대한 항균활성 검정
노루궁뎅이버섯을 1회 재배와 3회 재배한 수확후 배지 로 구분하여 풋마름병균 1401과 1402에 대하여 위와 같은 방법으로 버섯 수확후 배지 추출물을 추출하였다. 원심분 리한 수확후 배지(1회 재배 수확후배지, 3회 재배 수확후 배지) 추출물을 0.2 μm syringe filter를 이용하여 여과한 후 직경 8 mm 필터페이퍼에 300, 400, 500 μL씩 충분히 흡수시킨 후, 토마토 풋마름병균주와 혼합하여 분주한 luria bertani (LB) agar 배지에 치상하여 25οC에서 배양 24시간 후 저지원의 크기를 측정하였다.
토마토 풋마름병균의 접종농도 및 접종량별 발병 조사
풋마름병 병원균주는 Ralstonia solanacearum 1401 (Biovar3), R. solanacearum 1402 (Biovar4)를 사용하여 LB 액 체배지에 접종하여 28oC에서 180 rpm으로 24시간 진탕배 양하였다. 토마토 종자(서광)를 파종 21일 후의 토마토 식 물체에 뿌리에 상처를 낸 후 24시간 동안 배양한 1401과 1402 균주를 104, 105, 106 CFU/mL 의 농도로 희석하여 30 mL과 50 mL씩 관주하여 접종 7일 후에 발병도(%)를 조사 하였다[16].
수확후 배지 추출물 처리농도 및 처리기간별 토마토 풋마 름병 억제 효과 검정
노루궁뎅이버섯을 1회 재배한 수확후 배지를 이용하여 위와 같은 방법으로 추출하였다. 풋마름병원균 1402 균주 를 LB 배지에 접종하여 28oC에서 180 rpm으로 24시간 진 탕배양하였다. 토마토 종자를 파종 4주 후 버섯 수확후 배 지 추출물을 1:2와 1:3으로 희석하여 50 mL/포트씩 관주 처리 하였다. 관주처리 24시간과 96시간 후 토마토(서광) 뿌리에 상처를 낸 뒤 풋마름병균 1402 균주를 105 CFU/ mL 로 희석하여 50 mL씩 관주처리하였다. 병원균 접종 7 일 후 발병도(%)를 조사하였다[5].
토마토 풋마름병의 발병 조사는 0 =정상, 1 = 1~25% 시 들음, 2 = 26~50%, 3 = 51~75%, 4 = 76~100% 시들거나 고 사로 구분하였으며, 발병도는 [(발병지수별 개체수 × 발병 지수)/(조사개체수 × 4)] × 100%로 계산하였다.
노루궁뎅이버섯 수확후 배지에서 폴리페놀 추출 및 토마토 풋마름병 발생 억제 효과 검정
노루궁뎅이버섯 수확후 배지에서 페놀화합물 추출은 30 g의 spent mushroom substrate (SMC)에 3 volume의 50% methanol, 70% methanol 및 97%의 ethanol로 homogenizer 사용 또는 사용하지 않고 추출하여 총 폴리페놀함량 을 Folin-Denis 방법(Folin and Denis, 1912)으로 측정하였 다. 추출용액 200 μL와 7% Folin- Ciocalteu's phenol reagent 500 μL를 혼합하여 3분 반응시킨 후 4% Na2CO3 500 μL을 첨가하고, 1시간 암조건에서 반응시켰다. 페놀화 합물 정량은 spectrophotometer (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 720 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 된 흡광도는 gallic acid를 이용하여 작성된 검량선을 이용 하여 총 페놀 함량을 조사하였다.
또한 노루궁뎅이버섯 수확후 배지에서 추출한 페놀 성분 에 대한 토마토 풋마름병에 대한 효과를 알아보기 위하여 노루궁뎅이버섯 수확후 배지에서 페놀화합물을 포함하는 50% methanol 추출액을 농축하고, 처리당 원예용 상토 (Balokeo; Seoul Bio, Eumseong, Korea)가 담긴 포트에서 생육한 토마토(슈퍼도태랑) 20주에 50 mL씩 관주처리하고 3일 후에 뿌리에 상처를 주고, R. solanacearum Biovar 3 균 주는 nutrient agar (NA) 배지에 접종하여 28oC에서 3일간 배양하여 106 CFU/mL로 조절한 풋마름병균 현탁액에 단 근침지하여 접종 14일 후에 풋마름병 발생을 조사하였다.
결과 및 고찰
토마토의 식물병원 곰팡이에 대한 항균활성
노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물과 PDA 배지를 혼합 하여 분주한 페트리디쉬상에서 토마토 식물병원곰팡이균 의 균사생장 저지율을 조사한 결과, 역병을 일으키는 Phytophthora capsici의 경우 균사생장을 완전히 억제하였으며, 겹둥근무늬병균 Alternaria solani, 시들음병균 Fusarium oxysporum, 잎마름병균 Corynespora cassiicola에서도 58.3~ 70.4% 균사생장을 억제하였다. 잘록병균 Rhizoctonia solani 와 균핵병균 Sclerotinia sclerotiorum에서는 43.2~46.6%, 잿 빛곰팡이병균 Botrytis cinerea은 23.1%의 균사생장 억제효 과를 나타내었다(Table 1, Fig. 1). 식용버섯의 수확후 배지 추출물들은 식물병원균에 대하여 균사생장을 억제하였으 며[23], 사과 검은별무늬병균 Venturia inaeqalis의 포자 발 아를 98% 억제한다고 보고한 바 있다[21]. 또한 양송이 수 확후 배지 추출물이 사과 검은별무늬병 발생을 감소시켰으 며[22], 잿빛만가닥버섯 수확후 배지 추출물은 오이 흰가루 병과 오이 반점세균병을 감소시켰고, 큰느타리버섯 수확후 배지 추출물은 유묘검정에서 오이 탄저병 방제에 67.7~ 87.8% 이상 효과를 나타내었다[19].
토마토 풋마름병균에 대한 항균활성
노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물의 토마토 풋마름병 균에 대한 항균활성 효과를 조사한 결과, 1회 재배한 수확 후배지에 비하여 3회 재배한 수확후 배지의 항균활성 효과 가 우수하였다(Table 2, Fig. 2). 특히 3회 재배한 버섯 수확 후 배지의 추출물의 경우 300~500 μL 처리시에 토마토 풋 마름병균의 생육을 0.7~1.8 mm 저지하였다. 1회 재배 배 지보다 3회 재배한 배지에서 풋마름병균을 억제하는 물질 이 다량 함유되어 있어 억제효과가 높은 것으로 생각된다. 이는 식용버섯의 배양여액이 식물병원곰팡이와 식물병원 세균의 성장을 억제한다고 보고하였고, 특히 식물병원세균 풋마름병균에 대하여 버들송이, 잎새버섯과 표고버섯의 배 양여액이 풋마름병균을 15.3~19.1 mm의 저지원을 나타내 서 배양여액에 항균물질을 함유하고 있는 것으로 추측된 다[24]. 이와 같이 노루궁뎅이버섯 수확후 배지에서도 항균 물질이 함유되어 식물병원곰팡이와 식물병원세균에 대한 친환경 방제로 이용될 수 있다고 생각된다.
토마토 풋마름병균의 접종 농도 및 접종량별 풋마름병 발생
버섯수확후 배지 추출물의 토마토 풋마름병에 대한 생물 검정을 위하여 병원형이 다른 1401과 1402 균주를 토마토 뿌리에 상처를 낸 후 접종농도별로 50 mL씩 관주 처리한 결과, 105 CFU/mL 이상의 접종농도에서 발병도가 100%로 나타났고, 30 mL씩 관주 처리에서 50/mL씩 관주처리 보 다는 낮은 발병도를 보였다(Table 3).
추출물의 처리농도 및 처리기간별 토마토 풋마름병에 대한 방제효과
노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물의 토마토 풋마름병 균 접종시기별 병 발생을 조사한 결과, 버섯수확후 배지 추 출물을 관주 처리 24시간 후 병원균 접종시 1:2와 1:3 처리 희석배수별 발병도와 이병주율 조사에서 방제효과가 저조 하였다(Table 4). 그러나 버섯수확후 배지 추출물 관주처리 96시간 후 병원균 접종시에는 1:2의 희석배수에서는 10%, 1:3에서 25%의 이병주율로 58.3% 방제효과를 나타내었다. 특히 1:2 희석배수 처리시에는 10.0%의 이병주율을 보여서 83.3%의 높은 방제효과를 나타내어 노루궁뎅이버섯 수확 후 배지 추출물을 4일 후 관주처리가 방제효과가 높았다 (Table 4, Fig. 3).
Table 4. Control effect of water extract from spent mushroom substrate of Hericium erinaceus on bacterial wilt of tomato at inoculation timing
aIn a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.
Fig. 3. Effect of water extract from spent mushroom substrate of Hericium erinaceus on disease severity of bacterial wilt of tomato caused by Ralstonia solanacearum. The disease symptom was observed after 7 days of inoculation. A, 24 hr after drenching; B, 96 hr after drenching.
버섯 수확후 배지 추출물이 저분자량이며 열에 안정하고 비단백질 대사물질로서 식물병원균의 생장을 억제는 한다 고 하였으며[21], 최근에는 잿빛만가닥버섯(Lyophyllum decastes) 의 수확후배지 추출물이 식물의 병저항성 PR-1 유전 자 발현이 증가되는 것으로 확인된 바 있다[19].
노루궁뎅이버섯 폐배지의 페놀화합물처리에 따른 토마토 풋마름병 방제 효과
노루궁뎅이버섯 수확후 배지로부터 50%와 70% methanol 추출물과 ethanol 추출 및 물 추출물 중에서 페놀함량 은 50% methanol 추출물에서 호모게나이저처리구와 비처 리구에서 130 mg/L로 가장 높게 나타났으며 물 추출물에 서도 100 mg/L 이상으로 페놀함량이 측정되었다(Fig. 4). 다른 추출방법에서도 90 mg/L 이상의 페놀함량이 측정되 었다.
Fig. 4. Phenol content in spent mushroom substrate of Hericium erinaceus using several extract solvents.
그리고 노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물의 페놀함량 에 따른 토마토 풋마름병 방제효과를 조사한 결과, 물 대조 구는 80% 이병주율을 보였으나, 물 추출물처리구에서 15% 의 이병주율로 81.3%의 높은 방제 효과를 보였다(Table 5). 페놀함량이 가장 많이 나타난 50% methanol 추출물은 30% 의 이병주율을 나타내어 페놀성분이 병 방제에 결정적인 요인으로 작용한다고 볼 수 없고, 다른 억제물질이 물 추출 물에 포함하는 것으로 추측할 수 있었다.
Table 5. Control effect of several extracts from spent mushroom substrate of Hericium erinaceus on bacterial wilt of tomato*
*The disease symptom was observed after 14 days of inoculation.
이상의 노루궁뎅이버섯 수확후 배지 추출물이 여러 식물 병원 곰팡이와 병원세균에 대하여 항균활성을 가지고 있으 며, 토양병해로서 방제가 어려운 토마토 풋마름병에 방제 효과가 있어서 화학농약을 대체할 수 있는 토마토 풋마름병 방제용 친환경자재로서 개발할 필요가 있다고 생각된다
