술의 풍미는 시각, 청각, 후각, 촉각, 미각의 오감에 의해 정해지나 증류식 소주에 있어서는 후각을 자극하는 향기 성분이 소주의 품질을 결정짓는 중요한 요소이다. 술의 향 기성분은 본질적으로는 효모가 가장 큰 영향을 미치며 효 모가 생성하는 주된 향기성분은 알코올, 카르보닐 화합물, 유기산, 에스테르, 함황화합물, 아민 등이다[1]. 이들 화합 물들은 효모의 대사과정이나 증류과정 중 생성되는데 술 덧의 산(acid) 함량과 관련이 있는 것으로 알려져[2] 일본 증류식 소주에는 citric acid 생성량이 많은 백국균(Aspergillus luchuensis)과 흑국균(A. awamori)을 사용해 왔고[3], 브랜디 제조에는 총 산함량이 0.8~1.0% 이상인 Ugni blanc 포도 품종을 원료로 사용해오고 있다[4].
이에 따라 각 나라는 산 농도가 높은 환경에서 발효 가 능한 효모를 증류주 제조에 사용함으로써 품질을 향상시 키고 제품의 경쟁력을 확보해 왔다. 이에 반해 우리나라는 1965년 양곡관리법 시행에 의해 증류식 소주제조가 어려 워지면서 주정을 이용한 희석식 소주가 자리매김하게 되 었고[5], 주정공장에서는 효소제를 이용하여 원료를 당화 하다 보니 비교적 안정적인 pH 환경에서 알코올 생산량이 높은 효모에 관심이 쏠리게 되었다. 최근 경제성장과 더불 어 향미가 좋은 고품질 증류주 수요가 증가하게 되면서 수 입 효모를 이용하여 증류식 소주를 제조하려는 시도가 있 었다[6]. 그러나 우리나라는 외국과 증류주 제조에 사용하 는 원료 및 방법이 다르고 일부 효모는 자국의 산업을 보 호하기 위해 해외로 수출하지 않기 때문에 우리 환경에 알 맞은 효모의 개발이 필요하다. 우리 연구팀은 국내 10개 지역 전통누룩을 수집, 증류식 소주제조 적합성을 조사한 결과 강원도 원주에서 구입한 누룩이 안정적인 발효특성 을 가지고 있고 일본 증류식 소주에 비하여 aldehyde류의 생산이 높은 특징이 있으며 일본인을 대상으로 한 관능평 가에서도 일본 소주보다 화려한 향을 갖는 것을 발견하였 다[7]. 이에 술덧으로부터 효모를 분리하여 특성을 조사한 바 pH 3.0에서 일본 소주제조용 효모 C4보다 증식이 우수 하였고 0.23~0.26%(citric acid) 정도의 산이 포함된 술덧 에서도 정상적인 발효가 가능한 것으로 나타났다[8]. 따라 서 분리된 효모를 국내 증류식 소주제조용으로 사용하고 자 동정하고 생리적 특성을 조사하였다.
분리효모의 동정 및 형태적 특징
분리균(N4)을 yeast-mold (YM) 액체배지에서 증식시킨 후 DNA를 추출하고[9] NL1과 NL4 primer[10]와 Prime STAR HS DNA Polymerase(Takara Bio, Kusatsu, Japan)를 이용하여 polymerase chain reaction(PCR) 증폭하였다. 이 어 ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 정제한 다음 ChromaPro l.5(Technelysium Pty, South Brisbane, Australia) 프로그램 으로 염기서열을 결정하였다. 분리균의 26S rDNA-D1/D2 염기서열을 Apollon DB-FU BLAST[11]를 이용하여 상동 성을 검색한 결과 자낭균류계 효모의 일종인 Saccharomyces cerevisiae의 표준균주 NRRL Y-12632(accession no. U448 06)와 100% 상동성을 나타내었다. Apollon DB-FU 외에 GenBank/DDBJ/EMBL에 수록되어 있는 database에 대한 상동성 검색 결과에서도 분리균의 염기서열은 S. cerevisiae 로 등록되어 있는 다수의 database에 대하여 100%의 상동 성을 나타내었다. 염기서열을 바탕으로 작성한 계통수에서 분리균은 Saccharomyces속에 구성된 클러스터에 포함되었 고 S. cerevisiae NRRL Y-12632와 동일한 분자계통학적 위 치를 나타내었다(Fig. 1).
Fig. 1. Phylogenetic tree of isolate strain (SIID15224-01-26S) with related species. Neighbor-joining tree was based on 26S rDNA domain D1-D2.
분리균의 형태는 돌기가 없는 매끄러운 모양의 융기형태 이며 광택성을 가지고 있고 표면은 평활하고 색은 백색에 서 크림색을 띠었다(Fig. 2). YM 평판배지에서 배양시작 1 주일 후 영양세포는 아구형에서 계란모양의 긴타원형으로 변하였고 다극출아에 의해 증식되는 것으로 확인되면서 전 형적인 S. cerevisiae의 형태학적 특징[12]을 보였다. 그러나 배양시작 1~2개월 경과한 평판에서 유성 생식기관의 형성 은 나타나지 않았다.
생리적 특성
분리균의 생리적 특징을 Table 1에 나타내었다. 당류 중 glucose, galactose, maltose, sucrose를 이용하여 발효할 수 있었으나 이당류인 trehalose와 melibiose를 발효할 수 없 는 것은 표준균주와 동일하였으나 비교균주와 달리 삼당 류인 raffiinose를 발효할 수 없는 것으로 나타났다. 탄소원 자화성에서는 발효성당 이외에 trehalose, raffiinose를 포 함한 methyl-glucoside를 자화할 수 있었던 반면 inositol, galactitol 등의 당알코올 등은 당화할 수 없었다. 특히 비교 균주와 달리 ethanol을 자화할 수 없는 특성을 가지고 있었 다. 질소원은 표준균주와 동일하게 nitrate에서 cadaverine 까지 모든 질소원을 자화하지 못했다. 분리균은 40oC 이상 에서는 증식하지 못했으며 단백질 합성저해제인 cycloheximide에 대한 내성은 관찰되지 않았지만 50% glucose와 10% NaCl 농도에서 성장할 수 있었다. 이외에 비타민 요구 성이 없는 것으로 조사되었다. 이러한 생리·생화학 특성은 Kurtzman 등[12], Barnett 등[13]의 기술내용 이외에 CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures)의 표준균주 CBS 1171(NRRL Y-12632와 동일균주)와도 매우 유사한 것으로 나타났다. 이상의 26S rDNA-D1/D2 염기배열, 형태관찰 및 생리적 특성을 종합하여 분리균을 S. cerevisiae로 동정 하고 S. cerevisiae N4의 이름으로 농업유전정보자원센터에 기탁(KACC 93224P) 하였다.
적 요
본 연구에서는 국내 전통누룩에서 분리한 증류식 소주용 효모의 생리적 특성을 조사하고 동정하였다. 분리균(N4)의 26S rDNA-D1/D2 염기배열은 Saccharomyces cerevisiae 표 준균주(NRRL Y-12632)와 100% 상동성을 나타내었고 다 극출아에 의해서 증식하였다. Glucose, galactose, maltose, sucrose를 발효할 수 있으며 trehalose, raffinose, methylglucoside를 자화할 수 있었다. 40oC 이상에서는 증식하지 못했으며 50% glucose와 10% NaCl 농도에서 성장할 수 있 었다. 염기배열, 형태관찰 및 생리적 특성을 종합하여 분리 균을 S. cerevisiae로 동정하였다.
