내생균류는 식물의 잎, 줄기, 뿌리 등 식물체의 다양한 부 위에 분포하고 있다[1]. 특히, 이들은 식물의 정상적인 생육 을 어렵게 하는 건조, 고온 및 염분 등의 생장저해조건들에 대해 저항성과 염내성 등의 특성을 부여하며[1-3] 생장촉진, 항균효과 및 면역활성에 영향을 미친다[1, 4, 5]. 이들 내생 균류는 식물과 공생하면서 다양한 이차대사산물을 생산하 며, 특히 식물생육발달에 관여하는 이차대사산물(secondary metablites)로써 식물호르몬으로 알려진 옥신(auxin; IAA)과 아브시스산(abscisic acid; ABA) 및 다양한 종류의 지베렐린(gibberellin; GA)을 생산한다고 보고되고 있다[3, 6, 7]. 지베렐린은 diterpenoid 복합체로서 종자발아, 줄기신 장, 개화촉진, 과육성숙, 식물의 생장 등에 관여하며[8-10], 현재까지 136 종류의 지베렐린이 보고되고 있다. 대부분의 지베렐린은 생합성 과정의 중간 대사산물로 알려져 있고, 생리활성을 나타내는 지베렐린은 소수에 불과하며 GA1, GA3, GA4 및 GA7등이 보고되어 있다. 국내에서는 최근 들 어 다양한 환경에 자생하는 식물-내생균류의 공생관계에 대한 연구가 조금씩 이루어지고 있으며, 식물생장에 관여 하며 지베렐린을 생산하는 내생균류로는 Arthrinium [11], Aspergillus [12], Cadophora [13], Cladosporium [7], Paecilomyces [14], Penicillium [6] 및 Phoma [15]속 등의 균주 들이 보고되고 있다.
본 연구는 우리나라 농경지에 자생하는 들깨의 뿌리로 부터 내생균류를 분리 동정하고 식물의 생장촉진 활성을 가지는 균류의 이차대사산물을 분석하여 내생균류의 특성 을 확인하였다.
본 연구에서는 경상북도 성주군에 위치하고 있는 농경지 에서 들깨(Perilla frutescens var. japonica Hara)를 채집하 여 내생균류 분리를 위한 식물시료로 사용하였다. 식물시 료는 뿌리를 세척하여 뿌리 주변부의 토양을 제거하고, 계 면활성제(Tween 80), 표백제(perchloric acid 1%) 및 차아 염소산나트륨(sodium hypochlorite 1%)을 이용하여 표면 을 세척살균 하였다[6, 13]. 멸균된 거즈로 수분을 제거한 뿌리시료를 2~4 cm 길이로 절단하여 실험재료로 사용하였 다. 내생균류의 분리를 위하여 뿌리시료로부터의 세균증 식을 선택적으로 억제하기 위한 방법으로 스트렙토마이신 (streptomycin) 80 mg/L이 포함된 hagem minimal (HM) 한천배지를 사용하여 25°C에서 3~5일간 배양하였다[16- 18]. 최종적으로 뿌리시료의 말단 단면에서 생장한 균사를 획선도말을 이용한 계대배양법을 통하여 형태학적으로 서 로 상이한 총 15균주를 순수 분리하였다.
이들 내생균류들의 식물생장촉진활성을 조사하기 위하 여, 내생균류를 25°C 암조건에서 180 rpm으로 Czapek broth medium (CBM)에 접종하여 7일간 진탕배양 하였다. 배양여과액(30 mL)을 동결건조한 후, 30배 농축액으로 제 조하여 난장이벼(waito-c rice)에 처리할 시료로 준비하였 다[6, 13]. 난장이벼의 종자는 24시간 동안 uniconazol (Sumitomo Chemical, Tokyo, Japan) 20 mg/L과 prochloraz 25% 용액(spotac)을 2,000배 희석액을 사용하여 살균처리 하였고 발아한 종자를 멸균된 water agar (0.5%)에 파종하 였다. 이엽기 엽액 부분에 농축된 내생균류의 배양여과액 (10 μL)을 처리하여 7일간 유묘의 생장을 관찰하였다. 대조 구로는 멸균증류수(sterile distilled water, SDW)와 농축된 CBM을 같은 조건으로 만들어 사용하였고, 난장이벼의 지 상부길이(shoot length)와 식물체길이(plant length)를 측정 하였으며 이를 총 3 반복하였다. 통계처리는 SPSS 프로그 램(version 18.0; IBM Co., Armonk, NY, USA)을 사용하여 일원배치분산분석(ANOVA)으로 기술통계값을 확인하였고, 사후검정은 Duncan's multiple range test (DMRT)의 방법 [13]을 사용하여 유의확률 p<0.05 수준에서 분석을 하였다 (Data not shown). 난장이벼의 생장촉진활성 결과를 보면 지상부 길이는 SDW 처리군에서 4.94 cm를, CBM 처리군 에서는 5.48 cm를, 이와 대조적으로 Y2H001 균주의 culture filtrates (CF) 처리군에서는 9.74 cm의 생장촉진 결과 를 나타내었다. 식물체 길이는 SDW 처리군에서 9.20 cm를, CBM 처리군에서는 10.26 cm를, 이와 대조적으로 Y2H001 균주의 CF 처리군에서는 17.90 cm의 생장촉진 결과를 나 타내었다(Table 1).
Table 1. Growth promotion of waito-c rice seedlings by lyophilized culture filtrates of endophytic fungi isolated from Perilla frutescens
Ten microliters of lyophilized fungal culture filtrates was treated to waito-c rice seedlings. The shoot and plant length of the waitoc rice seedlings were observed after a week of treatment. According to Duncan’s multiple range test (p < 0.05), the different letters in a row indicate significant differences. Data are expressed as mean value ± standard deviation.
SDW, sterile distilled water; CBM, lyophilized Czapek broth medium.
NCBI GenBank로부터 accession no.를 부여받은 Y2H001 균주의 ITS영역 염기서열(KT462567)과 β-tubulin 유전자 염기서열(KT462568)을 결합하여 표준균주와 문헌자료를 통하여 계통분석을 수행하였다. 그 결과 당 균주는 분류학 적으로 Aspergillus속의 section Flavi에 포함되었으며, 분자 계통학적 분석결과 A. flavus로 동정되었다(Fig. 1).
Fig. 1. Phylogenetic position of Aspergillus flavus Y2H001 based on sequences data of combined of partial internal transcribed spacer region and partial β-tubulin. DNA sequences of the A. flavus Y2H001 strain was compared with type strains belonging to Aspergillus section Flavi [22]. Dendrogram was constructed by the maximum likelihood method and Kimura 2-parameter algorithm (1,000 bootstrap replications) with MEGA 6 software. The “T” after the collection number indicates the type strains of the species. Bootstrap values (70%) are indicated at relevant nodes. (scale bar = 0.05)
형태학적 관찰은 malt extract agar (MEA), czapek yeast extract agar (CYA) 및 creatine sucrose agar (CREA) 배지 상에서 배양한 Y2H001 균주를 기반으로 실시하였고, 배 양조건은 공통적으로 25°C의 암조건에서 7일간 배양하였 다. MEA 배지에서 생장한 균체는 광학현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 분생포자경과 분생포 자를 관찰하였다.
A. flavus Y2H001 균주의 미세형태 관찰을 위해 MEA 배 지에서 배양하였고 콜로니가 4.5 × 3.5 cm로 관찰되었으며, CYA 배지는 5.0 × 4.5 cm를, CREA는 2.5 × 2.5 cm의 크기 를 나타내었다. Y2H001 균주의 분생포자경의 자루(stipe) 는 800~1,500 × 8.0~12.5 μm 크기에 표면이 조금 거칠었 고, 경자(phialides)는 15~30 × 3.5~5.5 μm 크기였으며, 소 낭(vesicle)은 27~35 × 27~38 μm였다. 또한 분생포자는 3~ 3.5 × 3~3.5 μm 크기인 것을 관찰할 수 있었다. 분자계통 학적 특징과 형태학적인 특징을 토대로 Y2H001균주는 A. flavus로 동정되었다[22] (Fig. 2).
Fig. 2. Aspergillus flavus Y2H001. A, Colonies on malt extract agar; B, Colonies on Czapek yeast extract agar; C, Colonies on creatine sucrose agar; D~G, Conidiophores and conidia; H~I, Conidia (scale bars: D~G = 20 μm, H~I = 5 μm).
A. flavus Y2H001 균주의 이차대사산물을 분석하기 위하 여 배양여과액의 pH를 조정하고 내부표준물질로는 20 ng 의 [17, 17-2H2] GAs를 추출하기 전에 배양여과액에 첨가 하였으며, 배양여과액에 ethyl acetate (EtOAc)를 첨가하여 pH를 조정하였다. 시료는 C18 column (90~130 μm, 60 pore size, Altech)과 Celite/SiO2 column (용매 formic acid 로 포화된 ethyl acetate : hexane = 95 : 5)을 이용하여 농 축된 시료로 준비하였다. Y2H001 균주가 생산하는 이차대 사산물의 분석을 위하여 high-performance liquid chromatography (HPLC) column은 μ BondaPak C18 column (3.9 × 300 mm)을 사용하였고, 분획시료를 gas chromatography mass spectrometry (GC/MS)에 주입하였다[5, 6, 12]. 그리 고 5973 Network Mass Selective Detector (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 설치된 GC/MS를 이 용하여 hydrocarbon standard를 통해서 정량분석 및 KRI value를 나타냈다. 각 GA와 [2H2] GA internal standards (Obtained from Prof. Lewis N. Mander, Australian National University, Canberra, Australia)의 3개의 ion mass를 비교하여 정량 분석하였다[6, 7]. 그 결과 A. flavus Y2H001 균주의 이차대사산물에서 GA3 (1.954 ng/mL)가 확인되었 다(Fig. 3).
Fig. 3. On gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) selected ion monitoring (SIM) analysis extracted from culture filtrate of Y2H001 strain, a bioactive gibberellic acid (GA) was detected [12]. The GC-MS SIM spectra for GA3 in culture filtrate of the Aspergillus flavus Y2H001. Arrow indicates the peak of fungal GA3 that coincides with that of internal standard GA3. A, GC-MS peak of culture filtrate, and GA3 standard; B, Ion value of standard GA3.
본 연구는 들깨의 뿌리로부터 분리된 내생균류가 들깨 생육에 미치는 영향을 확인하기 위하여 난장이벼의 유묘를 대상으로 생장촉진활성을 검정하였다. 생장촉진활성을 나 타낸 Y2H001균주의 분자계통분석과 형태학적 관찰을 통 해 A. flavus로 동정하였으며 A. flavus Y2H001균주의 배 양 여과액을 분석하여 GA3를 생산하는 것이 확인되었다. 현재까지 알려진 GA는 136종류이지만 4종류 만이 식물생 장활성에 관여한다고 보고되고 있으며, 특히 식물과 공생 관계인 내생균류가 이차대사산물로써 생산한다고 보고되 고 있다. 모든 내생균류가 GA를 생산하는 것은 아니고, 이 들만의 특이적인 생합성 유전자와 관련되었다고 할 수 있 다[23]. 최근에 들어서 다양한 환경에 자생하는 식물과 공 생관계인 내생균류의 GA생산 연구가 발표되고 있지만[7, 12, 13], 특정한 균주가 GA를 생산한다는 보고는 없으며, 생태계에 따라서 내생균류만의 생리적인 진화가 이루어졌 다고 할 수 있다. 최근 국외에서는 식물-내생균류의 연구가 점차적으로 보고되고 있으며, 내생균류의 다양한 이차대사 산물 생산과 관련된 것으로 보여진다. 그리고 국내에서는 내생균류에 대한 보고가 많이 이루어지지 않아 확대된 연 구가 필요할 것이며, 본 연구에서 보고하는 A. flavus는 곰 팡이 독소인 aflatoxin [23]을 생산하는 균주로서 많이 알려 져 있다. A. flavus와 다른 균주의 혼합배양을 통하여 aflatoxin을 생산에 대한 연구와 배양조건[24], 환경 또는 다른 물질첨가 등에 따라 aflatoxin의 생산과 생합성 유전자에 대한 연구들이 이루어지고 있다[25, 26]. 본 연구에서 분리 된 A. flavus는 식품분야에서 곰팡이 독소와 관련하여 많이 연구되었지만, 환경분야에서는 보고가 잘 없는 상황이다. 그리고 추후에 GA를 생산하는 다양한 내생균류에 대하여 GA 생합성 비교분석 연구가 필요할 것으로 생각된다.
본 연구에서는 들깨의 뿌리에서 식물의 생육발달에 긍정 적 영향을 미치는 A. flavus를 분리하여 GA를 생산하는 새 로운 균주로서 보고한다. 그리고 농작물을 포함하는 다양 한 생태계의 식물들과 내생균류에 대한 연구의 중요성과 이들 내생균류가 생산하는 다양한 이차대사산물에 대한 연 구가 필요할 것이다.
적 요
경상북도 성주군의 농경지에서 자생하는 들깨를 채집하 여 이로부터 형태학적으로 상이한 15개의 내생진균을 순수 분리하였다. 이들의 배양여과액을 이용하여 난장이벼의 유 묘에 처리하여 식물생장촉진 활성을 조사한 결과, 이들 중 Y2H001균주가 식물생장활성이 가장 우수한 것으로 나타났 다. Y2H001균주의 ITS영역 염기서열과 β-tubulin 유전자 염기서열을 사용하여 계통학적 유연관계를 확인하였으며, 이러한 분자계통학적 분석 및 형태학적 관찰을 통해 Aspergillus flavus로 동정되었다. 또한 A. flavus Y2H001균주의 배양여과액을 GC/MS를 통하여 분석하였고 식물생장을 촉 진하는 원인물질로 GA3 (1.954 ng/mL)를 생산하는 것을 확인하였다.
