Baseline Sensitivity and Monitoring for the Resistance to Benomyl of Fusarium Species Causing Bakanae Disease in Korea

시험균주 및 병원성 검정

이전에 prochloraz 약제에 대한 저항성 변화 연구에 사용 되었던 2006년부터 2007년, 그리고 2013년부터 2014년에 분리한 590개 균주를 대상으로 시험을 수행하였다[2]. 전국 에서 수집한 벼 키다리병균을 단포자 분리하고, 감자한천 사면배지(potato dextrose agar, PDA)에 배양하여, 10ºC에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리한 균주는 균학적 특 성조사와 TEF (translation elongation factor 1 alpha) 유전 자의 염기서열 분석을 통해 종을 동정하였다. 또한 포자현 탁액에 벼 종자를 침지하여 시험관에 파종하는 실내 검정 방법으로 병원성 검정을 수행하였다[2]. 이 중 2006년부터 2007년에 분리한 120개 균주와 2013년부터 2014년에 분리 한 365개 균주를 선발하여 benomyl에 대한 약제반응시험 을 수행하였다.

벼 키다리병균의 benomyl에 대한 약제반응 조사

Benomyl (a.i. 50%, EC)에 대한 키다리병균의 감수성 정 도를 조사하기 위하여 한천희석법을 이용하여 균사생장 억 제 정도를 조사하여 비교하였다. 병원성이 확인된 485개 균 주를 PDA배지에 접종하여 25ºC에 7일간 배양하였고, cork borer (직경 5 mm)를 이용하여 균총을 절단하였다. 약제는 멸균수에 용해시켜 PDA배지에서의 최종농도가 각각 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.5625, 0.78125, 0.390625 μg/mL이 되도 록 첨가하였고, 약제를 혼합하여 만든 PDA배지 중앙에 균 총을 접종하였다. 병원균을 접종한 배지는 25ºC에서 7일간 배양한 후, 자란 균총의 직경을 측정하였다. 이 결과를 바 탕으로 균사생육을 완전히 억제하는 최소농도인 최소억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 값을 구하 여 연도별 저항성 변화 양상을 분석하였다. 또한, 측정된 균총의 직경과 약제를 첨가하지 않은 PDA 배지에서의 균 총 직경을 비교하여 균사생장 억제율(%)을 계산하였다. SigmaPlot version 12.3 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) 프로그램을 이용하여 균사생장을 50% 억제하는 농도 인 effective concentration of 50% (EC₅₀)값을 계산하였다.

균사생장 억제율(%) = [1 − (약제 배지에서의 균총직경 / 무처리 배지에서의 균총직경)] × 100

Benomyl에 대한 최소억제농도(MIC) 및 EC₅₀값의 변화

실내검정에 의해 병원성이 확인된 485개 균주에 대해 한 천희석법을 이용하여 약제반응을 조사하였다. MIC값의 분 포비율을 조사한 결과, 2006년부터 2007년에 분리한 120개 균주 중 91개 균주 (75.8%)의 MIC값이 1.5625~3.125 μg/ mL였고, 25 μg/mL 이상인 균주는 17개(14.2%)로 나타났다. 반면, 2013년부터 2014년에 분리한 365개 균주는 MIC값이 25 μg/mL 이상인 균주가 135개(37.0%)로 가장 많았고, 3.125~6.25 μg/mL인 균주가 127개(34.8%)로 나타났다(Fig. 1). MIC값의 분포를 전체적으로 살펴보면, 국내 키다리병 균주는 분리 연도에 상관없이 1.5625~3.125 μg/mL, 3.125 ~6.25 μg/mL와 25 μg/mL 이상의 MIC값에 주로 분포하는 것으로 나타났다. 이전의 연구에서 이들 균주는 prochloraz 약제에 대해서는 MIC값의 분포가 정규분포 형태로 나타나 benomyl과는 차이를 나타냈다[2]. 이것은 두 약제의 계통 차이에 의한 특성과 살균제 저항성 기작의 유전 방식 등과 관련된 것으로 추정된다.

Fig. 1. Minimum inhibition concentration (MIC) of benomyl against the mycelia growth of Fusarium species isolated from infected rice plants in 2006~2007 and 2013~2014.

2006년부터 2007년 분리균의 EC₅₀값 범위는 0.825~5.3015 μg/mL이었고, 평균값은 1.6397 μg/mL이었으며, 2013년부 터 2014년 분리균은 0.3131~9.2385 μg/mL이었고, 평균값 은 2.4892 μg/mL로 2006년부터 2007년에 비해 EC₅₀값의 범위와 평균치가 증가한 것으로 조사되었다(Fig. 2). 또한 분리 연도별 EC₅₀값의 분포를 살펴보면, 2006년부터 2007 년 분리균에서는 존재하지 않았던 EC₅₀값 6.0 μg/mL 이상 인 균주가 2013년부터 2014년 분리균에서 확인되었다(Fig. 3). 이것은 국내 벼 키다리병균이 benomyl에 대한 저항성 이 증가하고 있음을 의미한다. Lee 등[5]은 2006년부터 2009년까지 국내에서 분리한 키다리병균의 benomyl에 대 한 저항성 분석 결과, 평균 EC₅₀값이 2.752 μg/mL였고 범 위는 1.051~9.261 μg/mL로 나타났다고 하였고, 이는 오히 려 본 연구의 2013년부터 2014년 분리균의 결과와 비슷한 수준이었다. 이것은 시험에 사용한 균주의 분리 연도, 균주 개수 및 병원성 등의 차이 때문인 것으로 생각된다.

이와 같이 분리 연도별로 MIC값과 EC₅₀값을 조사한 결 과, 25 μg/mL이상의 MIC값을 나타내는 균주가 증가하고, EC₅₀값의 분포범위와 평균값이 증가하였으며, EC₅₀값이 6.0 μg/mL 이상인 균주가 2013년부터 2014년 분리균주에서 확 인된 것으로 볼 때, 국내 키다리병균의 benomyl에 대한 저 항성이 증가한 것으로 판단된다.

Fig. 2. Variation of effective concentration of 50% (EC₅₀) value of Fusarium isolates collected from infected rice plants in 2006~2007 and 2013~2014.

Fig. 3. Frequency histogram of effective concentration of 50% (EC₅₀) values of isolates from infected rice plants in 2006~2007 and 2013~2014. Asterisk means significantly high EC₅₀ values of isolates collected in 2013~2014.

벼 키다리병균의 benomyl에 대한 저항성 기준

위에서 조사한 2006년부터 2007년 분리균의 MIC값과 EC₅₀값을 분석하여 국내 벼 키다리병균의 benomyl에 대한 저항성 기준을 설정하였다. 2006년부터 2007년에 분리한 총 120개 균주에 대한 분석 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같 이 3개의 그룹으로 나뉘어졌으며, 감수성 그룹(S)은 EC₅₀값 이 2.4 μg/mL 이하이고, MIC값이 12.5 μg/mL이하로 기준 을 설정하였다. 저항성 그룹은 다시 중도저항성(MR)과 저 항성(R) 그룹으로 구분하였는데, 중도저항성 그룹은 EC₅₀값 은 2.4 μg/mL 이하이지만 MIC값이 25 μg/mL이상일 때, 그리고 저항성 그룹은 EC₅₀값이 2.4 μg/mL 이상인 경우로 구분하였다. 감수성과 저항성 균주를 판단할 때, EC₅₀값과 MIC값의 크고 작음이 항상 일치하는 것은 아니다. 다시 말 해 EC₅₀값이 높다고 반드시 MIC값이 높은 것은 아니기 때 문에 저항성 기준을 설정할 때에는 EC₅₀값과 MIC값을 함 께 고려하는 것이 필요하다. 2006년부터 2009년까지 국내 에서 분리한 118개 균주에 대해 benomyl 저항성 기준을 판 단한 기존 연구에서는 저항성 기준을 EC₅₀값 2.5 μg/mL 이 상으로 설정하였다[5]. 이는 본 연구의 EC₅₀값과 유사한 결 과이지만, 앞에서 언급한 바와 같이 MIC값에 의해 확연히 구분되는 그룹이 존재하기 때문에 여기서는 MIC값과 EC₅₀ 값을 함께 고려하여 그 기준을 설정하였다. 또한, 중국에서 분리한 benomyl 저항성 벼 키다리병 균주의 tubulin 유전 자 염기서열 분석에 대한 연구에서는 감수성 균주의 EC₅₀ 값을 1.08 μg/mL, MIC값을 5 μg/mL이하로, 중도저항성 균주는 EC₅₀값과 MIC값을 각각 2.41 μg/mL과 50~100 μg/ mL로, 저항성 균주의 EC₅₀값을 3.32 μg/mL, MIC값을 100 ug/mL 이상으로 표현하며 MIC값과 EC₅₀값을 함께 나타낸 바 있다[3]. 따라서 국내 벼 키다리병균의 benomyl에 대한 저항성 기준은 MIC값이 25 μg/mL이상이고, EC₅₀값이 2.4 μg/mL 이하일 때는 중도저항성으로, EC₅₀값이 2.4 μg/mL 이상일 때는 저항성으로 하는 것이 타당할 것으로 생각된 다. 이와 같은 저항성 기준으로 국내 벼 키다리병균의 저항 성 변화를 분석한 결과, 2006년부터 2007년 분리 균주에서 감수성 균주는 85.8%였으나 2013년부터 2014년에는 62.5% 로 감소하였고, 저항성 균주는 12.5%에서 36.4%로 증가하 였다(Fig. 5). 이는 2006년부터 2009년까지 분리한 키다리 병 균주의 benomyl저항성 분포율이 36.4%였다는 이전 연 구 결과와는 큰 차이를 보였다[5]. 이것은 이전 연구와 본 연구의 저항성 기준의 차이, 균주의 분리 연도와 지역의 차 이 때문인 것으로 추정된다. 본 연구에서 사용된 동일한 균 주의 prochloraz 저항성균 분포 비율이 2006년부터 2007년 에 6.5%에서 2013년부터 2014년에는 41.6%로 약 6.4배 증 가한 것에 비하면 benomyl 저항성은 약 2.9배 정도의 증가 율을 보였다[2]. 이것은 국내 종자소독 약제로 prochloraz 약제를 가장 많이 사용하기 때문에 병원균이 약제에 노출 된 빈도가 높기 때문인 것으로 생각된다.

Fig. 4. Baseline of fungicide response resistant to benomyl on isolates of Fusarium species isolated during 2006~2007 in Korea. MIC, minimum inhibition concentration.

Fig. 5. Percentage of isolates to sensitive, moderate resistant and resistant to benomyl collected in 2006~2007 (120 isolates) and 2013~2014 (365 isolates). Fungicide response was decided with a baseline level of resistance.

본 연구의 저항성 기준으로 지역별 benomyl 저항성 분포 변화를 분석한 결과, 전남을 제외한 모든 지역에서 2006년 부터 2007년에 비해 2013년부터 2014년 분리 균주의 benomyl 저항성 분포 비율이 증가하였다(Table 1). 또한 중도 저항성은 강원과 충남 지역에서만 분포하고 있음이 확인되 었다. 특히 경기와 충남 지역의 경우, 2013년부터 2014년의 저항성균 분포 비율이 60% 이상으로 크게 증가하였으며, 충남 지역은 2006년부터 2007년에 6.1%였던 저항성균 분 포 비율이 71.9%로 심각하게 증가한 것으로 나타나 향후 이에 대한 대책이 필요할 것으로 생각된다. 특히 충남 일부 지역의 경우, 2000년대 초반부터 키다리병이 심각하게 발 생하였기 때문에 benomyl을 비롯한 다양한 종자소독 약제 를 사용해 왔고, 이로 인해 benomyl 저항성 균의 분포가 크게 증가한 것으로 판단되며, 이에 대한 면밀한 조사가 필요할 것으로 생각된다. 충북과 경남 지역은 2006년부터 2007년에는 benomyl 저항성 균의 분포가 확인되지 않았으 나 2013년부터 2014년 분리균에서 저항성 균주의 분포율 이 각각 43.3%, 27.3%로 조사되었다. 한편, 전남 지역의 경 우, benomyl 저항성 균의 분포가 2006년부터 2007년 40.0% 에서 2013년부터 2014년 22.2%로 감소한 것으로 조사되었 다. Benomyl과 같은 benzimidazole계 약제 저항성균은 생 태 적응력이 감수성균에 비해 떨어지지 않기 때문에 약제 사용을 중단하여도 저항성 균의 밀도는 줄어들지 않는 것 으로 알려져 있으나[7], 20년 이상 benomyl의 사용이 중단 된 이후 저항성 균의 출현빈도가 급격히 감소되었다는 보 고도 있어[8] 전남 지역의 저항성 균의 감소 원인에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다. 또한 국내의 벼 키다리병 균 약제저항성 관리 측면에서 향후 지역별 농가의 benomyl 사용 빈도별 저항성 균의 분포 비율, 병원균의 benomyl 저 항성 발현 기작 등이 구명되어야 할 것으로 생각된다.

Table 1. Frequency of sensitive, moderate resistant, and resistant isolates to benomyl from each province in Korea

Benomyl과 prochloraz 약제에 대한 다중저항성 분석

이전 연구에서 수행한 prochloraz 살균제에 대한 약제반 응과 benomyl에 대한 약제반응 결과를 조합하여 두 가지 살균제의 다중저항성 여부를 분석하였다. 2006년부터 2007 년에 분리한 120개 균주 중 4개 균주(3.3%)가 두 가지 약 제에 대해 다중저항성을 나타냈다. 반면, 2013년부터 2014 년에 분리한 균주의 경우, 365개 균주 중 74개 균주 (20.3%) 가 두 가지 약제에 대해 모두 저항성이 있는 것으로 조사되 었다(Fig. 6). Lee 등[5]은 2006년부터 2009년에 분리한 118 개 균주를 대상으로 prochloraz와 benomyl에 대한 다중저 항성을 조사한 결과, 118개 균주 중 11개 균주가 다중저항 성을 나타내었으며, 이 중 2개 균주는 tebuconazole에도 저 항성을 나타내어 3종의 약제에 대해 다중저항성임을 보고 하였다. 일반적으로 benomyl과 같은 benzimidazole계 약제 와 prochloraz와 같은 DMI계 약제 사이에는 교차저항성이 없는 것으로 보고되어 있다[9]. 그러나 본 연구에서는 두 약제에 대한 다중저항성 균주가 크게 증가한 것으로 나타 났고, 이것은 여러 약제에 대해 저항성을 가진 병원균의 집 단이 늘어난 결과이거나 한 가지 약제에 대한 저항성의 증 가가 또 다른 유전적 변이에 의해 다른 약제에 대한 저항성 을 증가시킨 것으로 추정해 볼 수 있으나 이에 대한 정확한 원인분석이 필요할 것으로 생각된다. 또한 benzimidazole 계 살균제 저항성 균의 방제를 위하여 N-phenylcarbamate 계 살균제의 역상관 교차저항성을 이용하였는데[10], 두 계 통의 합제 사용 이후에도 두 살균제에 모두 저항성을 나타 내는 다중저항성 병원균의 출현이 보고되어 다중저항성의 위험성이 제기된 바 있다[11]. 특히 벼 키다리병의 경우, 다 중저항성에 의해 종자소독 효과가 저하되고, 이로 인해 병 발생이 증가할 가능성이 있으므로 각 약제에 대한 저항성 기작을 구명하는 것이 필요하다고 하였다[5]. 한편 benomyl은 병원균의 β-tubulin 단백질의 중합 반응을 억제하고 미세소관의 생성을 방해하는 기작으로 병을 방제하는 것으 로 알려져 있다[12]. Chen 등[3]은 중국에서 분리한 benomyl 저항성 키다리병균의 tubulin 유전자 중 돌연변이(point mutation)가 일어난 부위는 β₂-tubulin의 198번, 200번, 235번 codon임을 보고하였으나 국내 벼 키다리병균의 경 우에는 이와는 다른 부위에서 돌연변이가 일어난 것으로 조사되었다(데이터 미제시). 따라서 국내 벼 키다리병균의 저항성 특성이나 다중저항성 증가와의 관련성 등을 유전자 변이와 함께 연구할 필요가 있다.

Fig. 6. Cross resistance patterns of prochloraz and benomyl fungicides in Fusarium isolates collected from infected rice plants in 2006~2007(A) and 2013~2014(B).

이와 같은 결과를 종합해 보면, 국내에 분포하는 벼 키다 리병균의 benomyl 저항성 균주 분포가 증가하였으며, 특히 지역적으로 저항성 균의 분포 비율이 증가하는 추세이고, 경기와 충남 지역의 경우 저항성 균의 분포가 크게 증가한 것으로 조사되었다. 또한 최근에 분리한 균주의 경우에는 prochloraz와 benomyl에 모두 저항성을 보이는 균주가 20.3%의 비율로 나타나 다중저항성의 증가 역시 우려된다. 따라서 벼 키다리병에 대해서는 다양한 종자소독제에 대해 지속적인 저항성 모니터링이 수행되어야 하고, 약제저항성 에 대한 효과적인 관리 방안이 마련을 위한 저항성 기작 구 명 등의 추가적인 연구가 반드시 필요할 것으로 생각된다.