내생균(endophytic fungi)은 일반적으로 식물에 병증을 나타내지 않고 식물 조직 내에 서식하는 균류를 말한다[1]. 일반적으로 내생균은 이차대사산물을 분비하여 병원균과 초식동물 등으로부터 식물을 보호하며, 고온이나 가뭄에 대 한 내성을 통해 식물에게 도움을 주는 것으로 알려져 있다 [2-4]. 내생균은 주로 자낭균류나 담자균류에 속하는 균류 로써 식물체의 지하부로부터 지상부에 이르기까지 다양한 식물 조직에서 발견되고 있으며, 거의 모든 식물에서 분리되 고 있어서 다양성 또한 매우 높은 것으로 알려져 있다[5].
침엽수는 세계적으로 약 600여 종이 분포하는 것으로 알 려져 있으며[6], 우리나라에서는 약 54종이 서식하고 있다. 내생균과 숙주식물 사이에 특이적인 관계가 크지는 않으나 겉씨식물인 침엽수는 속씨식물과는 상당히 다른 내생균과 진화해온 것으로 알려져 있다[7]. 특히 최근에는 침엽수 내 생균으로부터 택솔(Taxol)과 같은 다양한 물질을 분리하여 활용하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다[8, 9]. 본 연구 에서는 침엽수에 공생하는 내생균의 다양성을 확인하기 위 하여 경기도 및 강원도의 산림에 서식하는 3종의 침엽수에 서 내생균을 분리하여 동정하였으며 3종의 내생균이 국내 미기록종으로 확인되어 보고하고자 한다
경기도의 명지산(고도 1,252 m, N 37º 57', E 127º 25')에 서 소나무속(Pinus L.)에 속하는 잣나무(P. koraiensis Siebold et Zucc.), 경기도 화악산(고도 1,468 m, N 37º 59', E 127º 30')에서 젓나무속(Abies Mill.)에 속하는 분비나무(A.nephrolepis (Traut.) Maxim.), 그리고 강원도의 설악산(고 도 1,708 m, N 38º 07', E 128º 22')에서 측백나무속(Thuja L.)에 속하는 눈측백(T. koraiensis Nakai)등의 소지를 채취 하였으며 48시간 내에 실험실로 운반하여 균 분리를 수행 하였다. 채집된 식물의 침엽은 수돗물로 세척 후 1% 차아 산염소산나트륨(NaOCl)에서 3분, 70% 에탄올에서 2분간 처리하고 멸균수로 세척하여 표면살균을 진행하였다. 그 후 침엽은 약 1 cm 정도의 크기로 준비한 후 potato dextrose agar (PDA)배지에 치상하였으며, 25ºC의 배양기에서 관찰하면서 발생한 균주들을 분리하여 계대배양하였다.
분리된 균주는 형택적 특징을 확인하기 위해 균총의 생 장과 크기, 색 등을 포함한 형태형질을 육안으로 관찰하였 다. 이후 균사 및 포자의 형태형질은 광학현미경(AxioImger A1; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였 다(Fig. 1). 염기서열 분석을 위해서 균사의 DNA를 Exgene Plant SV mini kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용해서 추 출하였으며, 추출된 DNA 시료를 주형으로 하여 균 특이적 인 primer인 ITS1F와 ITS4를 사용하여 rDNA의 internal transcribed spacer (ITS)지역을 증폭하였다[10]. Polymerase chain reaction (PCR) 수행 조건은 다음과 같다. 94ºC에 서 5분 간 pre-denaturation 후, 94ºC에서 30초 간 denaturation과 50ºC에서 30초 간 annealing 단계를 거치고 72ºC 에서 1분 간 신장시켰다. 이러한 과정을 총 30회 수행하였 으며, 최종적으로 72ºC에서 5분 간 처리하여 증폭산물을 안정화시켰다. 최종적인 PCR산물은 agarose gel 상에서 전 기영동방법을 이용하여 밴드를 확인한 후 염기서열 분석은 솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 분석된 염기서열들 은 NCBI 상에서 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 가장 유사도가 높은 분류군들을 선택하 였다. 선택된 분류군들은 염기서열 정렬을 거쳐 계통수 상 에서 염기서열의 유사도를 바탕으로 각 분류군의 위상을 확인하였다. Bootstrap 분석은 1,000회 반복으로 수행되었 으며, outgroup은 치마버섯(Schizophyllum commune)을 사 용하여 MEGA6 [11]에서 수행하였다(Fig. 2). 본 연구에서 사용된 염기서열은 GenBank에 등록하였으며, 균주 13C 019는 KU194425, 균주 13C145는 KU194426, 균주 13C319 는 KU194427을 부여받았다.
Fig. 1. Colony of strain 13C019 (Cryptosporiopsis actinidiae) grown on potato dextrose agar (PDA) (A, B) for 28 days and spores (C, D); 13C145 (Pestalotiopsis mangiferae) grown on PDA for 7 days (E, F) and spores(G, H); 13C319 (Pyrenochaet acava) grown on PDA for 7 days (I, J) and a brown microsclerotium (K) and hyaline allantoid spores (L). (scale bars: C, D, G, H, L = 5 um, K = 10 um).
Fig. 2. Phylogenic tree of unrecorded endophytic fungi, Cryptosporiopsis actinidiae, Pestalotiopsis mangiferae, Pyrenochaeta cava from conifer trees in the Korean peninsula. Internal transcribed spacer and 5.8S rDNA region were used to confirm the topological appropriation of the isolates. Schizophyllum commune was used as an outgroup.
Cryptosporiopsis actinidiae P.R. Johnst., M.A. Manning & X. Meier, Mycotaxon 89: 132 (2004)
PDA배지에서 28일간 배양된 균총은 반경이 약 30~33 mm 정도이며, 균사의 밀도는 다소 조밀하고, 공중균사가 발달하였다(Fig. 1A, 1B). 균총의 변연부는 원형으로 비교 적 일정한 형태를 유지하고 있으나 PDA배지에서 28일 이 상 배양 시에 반경 30~33 mm 정도에서 균사의 밀도가 매 우 희박해지며, 7.5 mm 정도 넓이의 환대를 형성한 후 다 시 다소 조밀한 균사가 발달한다. 표면의 색상은 흰색이나 환대에서는 엷은 미색이 나타나며, 표면에는 삼출물이 없 다. 포자의 크기는 5~10 × 2.5~5 um 정도이다. 포자의 전 체적인 형태는 직사각형의 원통형 모양이며, 양 말단은 반 구형의 둥그스름한 형태이다(Fig. 1C, 1D). 포자는 염주상 의 연속된 균사형태를 확인할 수 있었다. 포자의 색은 전체 적으로 투명하면서 연한 갈색을 띠었다. 이 균주의 rDNA 중 ITS지역에 대한 염기서열을 분석한 결과 C. actinidiae KF727420과 100%의 상동성을 보였다.
C. actinidiae는 키위(Actinidia spp), 사과(Malus domestica) 등 과실에 병을 일으키는 경제적으로 중요한 병원균 으로 2004년 처음 보고된 종으로[12], 내생균으로는 나한송 과(Podocarpaceae)의 다양한 종에서 분리된 것으로 보고되 었다[13].
관찰표본: 강원도 설악산, N 38º 07', E 128º 22', 눈측백 (Thuja koraiensis)의 침엽, 13C019 (NIBRFG0000137509, GenBank accession no. KU194425)
Pestalotiopsis mangiferae (Henn.) Steyaert, Bulletin du JardinBotanique de l'tat Bruxelles 19: 320 (1949)
PDA배지에서 7일간 배양한 균총의 직경은 약 30 mm 정 도이며, 균사의 밀도는 다소 성기고, 공중균사가 발달하였 다(Fig. 1E, 1F). 균총의 변연부는 비교적 일정한 형태를 유 지하고 있으나 변연부에서 균사의 발달이 다소 불규칙한 형태를 보이며, PDA배지에서 7일 이상 배양 시에는 변연 부가 매우 불규칙한 형태를 띠며 발달한다. 표면의 색상은 흰색과 미색이 불규칙하게 나타나며, 표면에는 삼출물이 없다. 뒷면은 표면과 비슷하게 미색을 띈다. 포자의 크기는 약 14.5~17.5 × 4.1~6.5 um 정도이며, 포자의 전체적인 형 태는 타원형의 단지 모양으로, 양 말단에는 투명한 부속지 가 부착되어 있다(Fig. 1G, 1H). 포자의 색은 전체적으로 갈색을 띠었으나 격벽의 색은 그보다 더 짙은 갈색을 띠고 있다. 이러한 타원형 단지 모양의 포자는 Pestalotiopsis spp. 의 대표적인 특징이며, 격벽의 개수와 부속지의 형태와 수 등은 종에 따라 차이를 보인다[14]. ITS 지역에 대한 염기 서열을 분석한 결과 Pestalotiopsis mangiferae GU722595와 100%의 상동성을 보였다.
Pestalotiopsis spp.는 주로 식물에서 병증을 일으키는 것 으로 알려져 있으며[15], P. versicolor는 주목(Taxus cuspidata) 에서 항암물질인 Taxol을 생산하는 것으로 보고되고 Fig. 2. Phylogenic tree of unrecorded endophytic fungi, Cryptosporiopsis actinidiae, Pestalotiopsis mangiferae, Pyrenochaeta cava from conifer trees in the Korean peninsula. Internal transcribed spacer and 5.8S rDNA region were used to confirm the topological appropriation of the isolates. Schizophyllum commune was used as an outgroup. 침엽수의 잎에서 분리한 국내 미기록 내생균 3종에 대한 보고 275 있다[9]. 우리나라에서도 여러 식물에서 병을 일으키는 것 으로 보고되고 있으며[16], 소나무(Pinus densiflora) 등에서 내생균으로 보고된 바 있다[17]. Pestalotiopsis mangiferae는 내생균으로 여러 가지의 이차대사산물을 생산하는 것으로 알려져[18] 활용 가능성이 높은 균주이다.
관찰표본: 경기도 화악산, N 37º 59', E 127º 30', 분비나무 (Abies nephrolepis)의 침엽, 13C145 (NIBRFG0000137639, GenBank accession no. KU194426)
Pyrenochaeta cava (Schulzer) Gruyter, Aveskamp & Verkley, Mycologia 102: 1076 (2010)=Phoma cava
PDA배지에서 7일간 배양한 균총의 직경은 약 24 mm 정 도이며, 균사의 밀도는 매우 조밀하고 촘촘하다(Fig. 1I, 1J). 공중균사는 발달하지 않았다. 균총의 변연부는 비교적 일 정한 형태를 유지하고 있으나 변연부에서 균사의 발달이 다소 불규칙한 형태를 보이며 대체적으로 파형을 나타내고 있다. 표면의 색상은 미색을 띄고 있으며, 표면에는 삼출물 이 없다. 뒷면의 중심부는 미색을 띄고 있으나, 그 외의 변 연부로 갈수록 황갈색을 띠고 있으며, 가장 외층은 밝은 주 황색을 띈다. 소핵균의 크기는 약 85.1~100 um 정도이며, 소균핵의 전체적인 형태는 원형으로 진한 갈색으로 관찰되 었다(Fig 1K). 포자는 투명하며 단세포로서 원통형이며 크 기는 약 2~3 × 1.0~1.5 um 정도이다(Fig. 1L). ITS지역에 대한 염기서열을 분석한 결과 Pyrenochaet acava HQ1156 98와 100%의 상동성을 보였다.
관찰표본: 경기도 명지산, N 37º 57', E 127º 25', 잣나무 (Pinus koraiensis)의 침엽, 13C319 (NIBRFG0000137680, GenBank accession No. KU194427)
본 연구에서는 우리나라 중부지역인 경기도와 강원도의 산림에 서식하는 침엽수로부터 내생균을 분리하였으며, 우 리나라에서는 처음으로 3종의 균을 확인하였다. 내생균은 식물의 생장에 도움을 줄 뿐만 아니라 다양한 물질을 생산 함으로써 병원균에 대한 생물제재 등에 활용가능성이 높은 것으로 생각된다. 따라서 침엽수를 포함한 다양한 숙주식 물을 기반으로 지속적인 내생균류의 발굴을 수행할 필요가 있으며, 이러한 노력을 통하여 침엽수에 공생하는 다양한 내생균 확인과 자원의 확보뿐만 아니라 침엽수와 내생균과 의 특이적 관계 및 상호작용을 파악하여 우리나라 생물자 원의 보존에 기여할 수 있을 것이다.
