우리나라 대표적인 채소인 배추는 뿌리혹병에 의해 가 장 큰 피해를 입으며 그 원인 병원균은 Plasmodiophora brassicae이다. 두 종류의 포자를 가지며[1], 십자화과 작물 에 감염되어 뿌리에 이상 생장을 초래하고 병 발생 후 17 년까지 휴면포자가 토양 내에 생존한다고 알려져 있다[2]. 이 병은 배추를 포함해 무, 순무, 브로콜리, 양배추, 케일, 갓, 비트 등 십자화과 작물에서 발생된다[3].
P. brassica는 순활물기생체로 배지에서 인공배양이 되지 않아 그 연구가 매우 어렵다. 따라서 뿌리혹을 채집한 다 음 그 뿌리혹을 장기보관하며 사용하는데 접종 시 냉동 보 관한 뿌리혹을 갈아 휴면포자를 분리해 접종하는 방법을 사용한다. 뿌리혹을 잘 보관하는 것은 병원균의 인공접종 에서 가장 중요한 문제 중 하나이다. 지금까지 배추뿌리혹병의 저장방법은 Woronin이 1877 년 논문에 발표한 그대로 -20ºC에서 뿌리혹 상태로 저장하 는 것이 일반적이고 보편적인 방법이다[4]. 그러나 이 조 건으로 오랜 시간 뿌리혹을 저장하면 병원균의 특성이나 병원성의 변화 등으로 인해 뿌리혹병균의 특성 연구를 정 확히 수행할 수 없고 병원균을 다른 기주에 재접종할 때 기주, 환경 등 다양한 요인에 의해 그 병원성이 변화될 위 험도 무시할 수 없다. 이처럼 오래 전부터 보편적으로 해 왔던 방식이라고 해도 약 140년 전에 사용했던 방법을 검 증과정 없이 그대로 따라하는 것 역시 문제가 있기 때문에 뿌리혹병균을 보관하는 가장 효율적인 방법을 찾을 필요 가 있다.
공시균주
배추뿌리혹병균(Plasmodiophora brassicae)의 공시균주 는 제주도를 제외한 전국 8개 시도 100여 개의 포장에서 뿌리혹을 채집하여 일부를 실험에 사용하였다. 수집한 뿌 리혹은 다음 실험을 위해 -70ºC에 보관하였다.
뿌리혹 저장조건
지금까지 사용되어온 저장방법을 개선하기 위해 최적의 저장조건을 알아보고자 다양한 조건과 온도에 뿌리혹을 저장하고 그 병원성의 지속여부를 확인하였다.
먼저 저장조건으로는 뿌리혹을 그대로 저장하는 것(Condition 1), Homogenizer로 마쇄한 것(Condition 2), 마쇄한 뿌리혹을 8겹의 거즈에 거른 것(Condition 3), 마쇄한 뿌리 혹을 8겹의 거즈에 거른 것에 20% glycerol 첨가(Condition 4), Condition 3에 건전한 배추 마쇄한 것(Condition 5)을 각각 처리하고 역시 Condition 3에 20% glycerol과 건전 배 추를 마쇄한 것을 같이 처리한 것(Condition 6)으로 정하였 다(Fig. 1). 온도조건은 -70ºC에서 보관된 뿌리혹을 가지고 -70ºC, -20ºC, 4ºC, 25ºC 4개로 구분하여 뿌리혹 상태로 저 장하였다.
Fig. 1. Schematic diagram of clubroot gall storage conditions tested in this research to find optimal storage condition.
병원성을 확인하기 위해서 처리별로 저장 후 3개월 단위 로 휴면포자를 모아 접종실험을 진행하였다. 병원성 지속 여부 검정을 위해 10일 정도 기른 감수성 품종[5]인 춘정 유묘(Woori Seed, Sejong, Korea)에 각각 조건별, 온도별 로 현탁액 관주 접종[6]하여 25 ± 5ºC의 온실에서 8주간 키 운 후 혹의 형성 유무를 통해 병원성 지속여부를 확인하였 다. 그리고 Choi [5]의 방법에 따라 등급을 나누고 발병도 (disease severity)는 Jang [7]과 Fähling 등[8]의 방법을 이 용하여 수식화하였다.
효율적인 뿌리혹 저장 조건
현재 뿌리혹병 연구자들이 흔히 사용하는 뿌리혹 저장 방법은 약 140년 전에 Woronin이 고안했던 방법이다. 이 방법은 뿌리혹을 그대로 -20ºC에 저장하는 것으로 단지 오 래 전부터 사용되었다는 이유만으로 검증과정 없이 사용 되어 왔다[9].
6가지의 저장 조건과 4가지의 온도 조건으로 총 24개의 조건하에서 뿌리혹을 저장하였고, 3개월마다 조건별로 저 장된 뿌리혹을 멸균수와 같이 마쇄한 106~107 spores/mL의 휴면포자 현탁액을 10 mL씩 감수성 품종에 접종하고 품 종에서의 발병 여부로 병원성을 검정하였다[10].
Kim 등[11]의 연구에 의하면 배추 뿌리혹의 부패에 미치 는 요인 중 다른 환경요인보다 온도가 가장 중요한 환경요 인으로 생각되며 온도가 낮을수록 다른 환경요인의 효과가 상대적으로 커진다고 보고하였다. 이 논문과 유사하게 4ºC 와 25ºC에서 저장하였을 때, 조건에 따른 병원성의 차이는 크지 않은데 반해 -70ºC에 저장하였을 때는 저장한 조건간 의 차이가 확연히 다른 것을 알 수 있었다.
그 결과 -70ºC에서 저장한 뿌리혹이 가장 오래 병원성을 유지하는 것을 확인하였으며 Duncan의 다중검정 결과에서 도 유의성 있게 나타났다(Figs. 2, 3). -20ºC에서 저장하는 것 역시 상대적으로 좋은 효과를 보았으나 -70ºC와 비교하 였을 때 저장 후 병원성이 감소하였고 특히 12개월이 지나 서는 발병률이 평균 51.7%에 그쳤다. 4ºC에서는 뿌리혹 저 장 3개월 후까지는 높은 발병률을 나타내다가 그 이후는 급격하게 발병률이 낮아지는 것을 확인할 수 있었는데, 이 는 3개월까지는 뿌리 내에서는 활발하게 생존하지만 이후 뿌리가 부패함으로 인해 저해 받은 것으로 판단된다.
통계분석시 유의차는 없었지만, -70ºC에서 저장한 6가지 저장법 중에서는 뿌리혹을 그대로 저장하는 것과 뿌리혹 을 갈아 균질화한 후 8겹의 거즈로 거른 것이 가장 오래 병 원성을 유지하였다(Fig. 4). -20ºC 저장에서는 뿌리혹을 균 질화하여 8겹의 거즈에 거른 것이 효과적이었다(데이터 미 제시).
Fig. 2. Test for effectiveness of storage conditions invented in this study. The resting spore suspension filtered from homogenized clubroot gall was used as a material for the test. The resting spore suspension was stored under specified temperature for certain period and stored under designed conditions were used as an inoculum to test its pathogenicity maintenance (A, stored at -70ºC; B, stored at -20ºC, after 21 months, respectively).
Fig. 3. Comparison of disease severity difference of the clubroot gall defending on storage temperature conditions (whole gall). Values followed by the same letter do not differ significantly at p > 0.05 according to Duncan's multiple range test (DMRT).
Fig. 4. Difference in disease severity defending on storage condition when the clubroot stored at -70ºC after 21 months storage. 1, Whole gall; 2, Homogenizing; 3, Homogenizing and filtration with 8 layers of gauze; 4, Condition 3 + adding 20% glycerol; 5, Condition 3 + adding homogenized disease free kimchi cabbage root; 6, Condition 3 + adding 20% glycerol + homogenized disease free kimchi cabbage root.
Devos 등[12]은 병원균이 2차 감염 과정을 거치지 않으 면 뿌리혹병 특유의 병징을 확인할 수 없다고 하였고, Feng 등[13]의 연구에서는 배추 삼출물이 존재할 때 삼출물이 없 을 때보다 뿌리혹병균의 휴면포자가 유주자로 발아가 많이 이루어진다고 보고하였다. 이는 2차 감염과 밀접한 관계가 있는 유주자의 발아에 배추의 삼출물이 영향을 미친다고 유추할 수 있다.
2차 감염을 하는 유주자의 발아에 영향을 주는 배추 삼출 물이 혹을 균질화하면서 배추 세포 내에 있던 휴면포자가 밖으로 드러나면서 배추 삼출물 역시 병원균과 함께 존재 하고 그 영향으로 휴면포자가 많이 발아하게 되고, 이후 발 아한 유주자는 굉장히 약한 상태로 외부자극에 의해 생리, 생장 기능 등에 영향을 받아 죽거나 병원성에 영향을 주었 을 것으로 판단된다. 또한 뿌리혹을 갈고 균질화한 것을 현 미경으로 관찰하면 휴면포자가 작게 균질화된 식물체 조직 에 밀접하게 붙어있는 것을 볼 수 있었는데, 이것이 인위적 으로 배추조직 마쇄한 것을 넣어주는 것보다 장기간 저장 하는데 더 효과적임을 확인할 수 있었다.
배추뿌리혹병에 걸린 배추는 토양세균의 2차 침입을 받 아 썩어 결국은 식물체 전체가 죽게 되는데, 감염된 세균이 뿌리혹을 저장할 때도 뿌리혹을 부패시킨다. 이 결과를 통 해 같은 병원균이나 뿌리혹이라도 -70ºC에서 배추의 삼출 물의 영향이 최소화된 상태로 저장하면 좀 더 병원균의 특 징이나 상태의 변화가 최소화된 상태에서 보다 정밀하고 정확한 연구를 오래 지속할 수 있을 것이라고 기대한다.
적 요
순활물기생체인 Plasmodiophora brassicae는 병원성 검정 을 위해서 반드시 뿌리혹을 장기적으로 보관하는 것이 매 우 중요하기 때문에 그동안 병원성을 유지하는 것이 관건 이다. 특히 기존의 방법은 100년 이상 사용되어온 저장법 으로 개선이 필요하여 그 효율적인 방법을 밝히고자 하였 다. 이 결과 장기적으로 병원성의 저하를 최소화하며 장기 간 뿌리혹을 저장할 수 있는 방법은 -70ºC 냉동고에 보관하 는 것으로 확인되었고, 저장 조건은 뿌리혹을 그대로 보관 하거나 뿌리혹을 갈아 균질화한 후 여러 겹의 거즈에 거른 것이 6가지 저장조건 중에 가장 효과적인 저장법으로 밝혀 졌다.
