Screening and Characterization of LTR Retrotransposons in the genomic DNA of Pleurotus eryngii

사용균주 및 배지

버섯 전이요소 연구를 위한 균주는 P. eryngii KNR2312을 사용하였다. 고체배양에는 MCM 배지(yeast extract 2 g/L, peptone 2 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L, KH₂PO₄ 0.46 g/L, K₂HPO₄ 1 gL, glucose 20 g/L, sucrose 20 g/L, agar 20 g/L)를 사용하였고, 액체배양에는 PDB 배지(Ventech Bio Co., Korea)를 사용하였다. 전이요소의 클로닝을 위한 숙주 세포로 Escherichia coli DH5α를 사용하였다.

버섯 genomic DNA 및 RNA 추출

PDB배지에서 1주일간 배양한 균사체를 멸균거즈로 걸러 모은 후, 증류수로 세척하였다. 모아진 균사체를 액체 질소로 동결 후, 막자사발로 갈아서 분말로 만들었다. 얻어진 균사분말 0.4 g에 0.5 ml isolation buffer (50 mM Tris-HCl, 170 mM EDTA, 1% N-lauroylsarcosine, pH 8.0)에 녹여 65oC에서 10분간 빈응시켰다. 반응액에 0.3 ml ammonium acetate (0.58 g/ml)를 첨가하고 섞어준 후, 얼음에서 10분간 방치시켰다. 원심분리 후(12,000 rpm, 5분), 상등액 0.7 ml에 0.5 ml isopropanol을 첨가하여 DNA를 침전시키고, 침전물을 원심분리하여 회수하였다. 회수된 침전물을 건조한 다음 0.1 ml TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 녹여 사용하였다. 버섯균사체로부터 전체 RNA추출에는 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하였다.

PCR 및 RT-PCR 조건

전이요소의 증폭을 위한 PCR은 genomic DNA (50 ng/μl) 3 μl에 forward primer와 reverse primer (10 pmole/μl) 각 1 μl를 첨가한 뒤, 증류수로 전체 volume이 20 μl가 되게 하였다. 이 혼합물을 PCR premix (Maxime PCR premix kit, Intron Biotech., Eumsung, Korea)와 섞은 후, 94ºC에서 5 분간 가열하였다. 이 후 94ºC에서 45초, 57ºC에서 45초, 72ºC에서 50초의 조건으로 총 35 cycle 증폭하였다. 증폭된 DNA는 TA클로닝 kit (pGEM-Teasy vector, Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 클로닝하였다. Reverse transcription-PCR (RT-PCR)은 Maxime RT-PCR premix kit(Intron Biotech., Sungnam, Korea)를 사용하였다. 이를 위하여 DNase를 처리한 RNA 3 μl에 각primer 1 μl씩을 첨가한 뒤, 증류수로 전체 volume이 20 μl가 되게 하였다. 이 혼합액에 RT-PCR premix를 첨가하고, 45ºC에서 30분간 반응시켰다. Reverse transcription 반응이 종료된 후, 상기 한 방법으로PCR 반응을 수행하였다.

Northern 및 Southern blot 분석조건

Northern blot과 Southern blot을 위하여 PCR로 염기서열이 결정된 각 전이요소의 특정부분(DNA길이 300~500 bp)을 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 분리 후, probe로 제작하였다. Probe제작에는 α-32P labeled dCTP (ICNBio- medicals, Costa. Mesa, CA, USA)를 사용하였다. Northern blot 분석에는 위에서 추출한 total RNA를 사용하여, 0.8% agarose gel에서 전기영동으로 분리한 후, positive-charged nylon membrane (Pall Co., East Hills, NY, USA)에 옮겨서 probe 검출하였다. Transfer membrane은 positive-charged nylon membrane (Pall Co., East Hills, NY, USA)을 사용하였다. Southern blot 을 위해서는 추출한 genomic DNA를 Hind III로 절단하였다. 절단된 DNA조각들을 northern blot과 같은 과정을 거친 후, 전이요소의 존재를 probe로 검출하였다.

전이요소 library 제작

버섯 유전체내에 존재하는 전이요소의 종류를 분석하기 위하여, 버섯전이요소 library를 제작하였다. 이를 위하여, 기존에 보고된 곰팡이균 Gypsy LTR retrotransposon에 포함된 Pol 단백질의 아미노산 서열 및 DNA 염기서열을 multiple sequence alignment 프로그램(Clustal Omega, http://www.ebi.ac.uk/)을 이용하여 분석하였다. 그 결과, Pol 단백질의 RT domain및 RVE domain(Fig. 2A)에서 높은 상동성을 보이는 부분을 발견하였다. 상동성이 높은 이 두 부분의 염기서열을 조사하여 RT domain 특이적 dege- nerated primer인 Degen1 set와 RVE domain에 특이적인 Degen2 set를 제작하였다(Table 1). 이 두 primer set를 이용하여 큰느타리버섯 유전체 DNA를 template로 하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, Degen1 primer set에서 약 500 bp, 700 bp 크기를 가진 두 개의 DNA band가 만들어졌으며, Degen2로부터는 500~900 bp 크기의 4개의 DNA band가 검출되었다(Fig. 2B). 큰느타리버섯 전이요소의 분석을 위하여 각 PCR 반응액을 모두 혼합 후 정제하였고, 이를 pGEM-T Easy 벡터에 TA 클로닝하였다(Fig. 2B). 제작된 전이요소 library는 대장균에 transformation 하였다.

Fig. 2. Construction of TE library. A, Multiple sequence alignments of RT domain and RVE domain of LTR retrotransposons. The boxes indicate the consensus sequence regions to design degenerated primer sets, Degen1 and Degen2 in Table 1. B, Generation of TE libraries using the degenerated primer sets. Lanes 1 and 2 are PCR with Degen1 and Degen2, respectively.

Table 1. Primer sets for the screening and isolation of transposable elements

LTR retrotransposon 분석

상기 library에 포함되어 있는 LTR retrotransposon 전이요소유전자를 분석하기 위하여 전이요소library를 LB-Ampicillin 배지에서 배양한 후, 256개의 콜로니들을 무작위로 선정하여 plasmid를 추출하여 삽입된 유전자의 염기서열을 결정하였다. 결정된 DNA 염기서열을 repetitive DNA 인자 분석 소프트웨어인 CENSOR(http://www.giri- nst.org/censor)를 이용하여 분석한 결과, 256개 중 71개가 LTR retrotransposon이었으며, 이들 중 Copia-48-PTR을 제외한 70개가 Gypsy-type LTR retrotransposon이었다(Table 2). 이는 library 제작에 사용된 degenerated primer가 Gypsy-type LTR retrotansposon의 서열을 기준으로 제작되었으므로, 당연한 결과라 할 수 있다. 70개의 Gypsy-type LTR retrotransposon 중에는 송이(Tricholoma matsutake)에서 발견된 MarY1(MarY1_TM)이 20개, 진황녹슨버짐버섯(Serpula lacrymans)의Gypsy-8_SLL이 26개, 생쥐의 LTR retrotansposon인 RMER17D_MM이 16개 발견되었고, SFV1-5B, Gypsy154-I, Gypsy-7_SLL이 각각 3개, 3개, 1개씩 발견되었다. 이상의 결과를 요약하면, 큰느타리버섯 유전체에는 다양한 종류의 Gypsy-type LTR retrotanspo- son이 포함되어 있음을 알 수 있고, 유사한 방법으로 Copia-type LTR retrotansposon을 분석하면 훨씬 더 많은 LTR retrotansposon이 큰느타리버섯 유전체에 포함되어 있을 것으로 예측된다.

Table 2. Isolated transposable elements (TEs) from TE-enriched library

^aOccurrence: Number of isolated TE sequences from the 256 randomly picked colonies harboring TE libraries.

^bCopy number: The copy numbers of TEs reside in the chromosomal DNA of Pleurotus eryngii measured by Southern blot analysis.

Retrotransposon 발현분석

생명체의 유전체에 포함되어 있는 다수의 전이요소들이 진화과정에서 유전자의 일부가 결실되어 비활성인 상태(degenerated)로 남아 있는 경우가 많다. 본 연구를 통하여 발견된 retrotansposon들이 실제 활성이 있는 전이요소인지를 확인하기 위하여 각 전이요소에 특이적인 primer (Table 1)들을 제작하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, MarY1_TM이 가장 많은 mRNA를 만들어 내어, 가장 활동적인 retrotansposon이었으며, Gypsy-8-SLL이 그 다음 순이었다. GYpsy154-I, SFV1-5B, Gypsy-7-SLL 등도 mRNA가 검출되어 활동성이 있는 retrotansposon임을 알 수 있었다(Fig. 3). 반면, Copia48-PTR은 매우 낮은 농도로 검출되어 활성이 상대적으로 낮음을 유추할 수 있었다. 특이하게, library에서 다수 검출되었던 RMER17D_MM의 경우에는 mRNA가 전혀 검출되지 않아서 유전체상에 비활성화된 형태로 여러 copy가 남아있는 것으로 추정된다. RMER17D_ MM를 제외한 6개의 retrotansposon mRNA에 대하여 Northern blot 분석을 수행하였다. MarY1_TM과 Gypsy-8-SLL에서 full length에 해당하는 10 kb 이상의 transcript가 관찰되었고, 나머지들은 절단된 형태의 mRNA가 관찰되었다(Fig. 3B). Northern blot 결과에서 특이한 점은 Gypsy-7-SLL의 mRNA량이 절단된 형태이지만, RT-PCR결과에 비하여 높게 나타난다는 것이다.

Fig. 3. Expression of TEs measured by RT-PCR (A) and Northern blot analysis (B). Lanes: 1, MarY1_TM; 2, Gypsy-8-SLL; 3, GYpsy154-I; 4, SFV1-5B; 5, Copia48-PTR; 6, Gypsy-7-SLL; 7, RMER17D_MM. RT-PCR was conducted using the primer sets P1-P7 in Table 2. The P32-labelled probes for Northern blot analysis were generated using the RT-PCR products.

Retrotransposon의 유전체내 copy수 분석

큰느타리버섯 유전체내 상기한 retrotansposon들의 copy수를 알기 위하여 큰느타리버섯 유전체를 HindIII로 절단하고(Fig. 4A), 이를 nylon membrane에 옮겨 Southern blot 분석을 실시하였고(Fig. 4B), 그 결과를 Table 2에 정리하였다. MarY1_TM과 Gypsy-8-SLL은 각각 14, 18 copy가 버섯 유전체 내에 존재하는 것으로 밝혀졌고, Gypsy-7-SLL을 제외한 나머지들은 모두 1 copy로 존재하는 것으로 보였다. Gypsy-7-SLL의 경우에는 최소 8 copy 이상이 존재하여, Northern blot에서 나타난 고농도의 mRNA transcript의 존재가 높은 copy수에 의한 것으로 설명될 수 있다.

Fig. 4. Southern blot analysis with HindIII-digested chromosomal DNA of Pleurotus eryngii. The same probes used in the Northern blot analysis were applied for this analysis. A, HindIII-digested chromosomal DNA of Pleurotus eryngii. B, Southern blot analysis. Lanes 1 and 2, MarY1_TM; lanes 3 and 4, Gypsy-8-SLL; lanes 5, GYpsy154-I; 6, SFV1-5B; 7, Copia48-PTR; 8, Gypsy-7-SLL.

본 연구팀은 retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism을 이용한 큰느타리버섯 균주의 분류기술을 개발하던 중, 균주의 퇴화가 심해질수록 LTR과 microsatellite간 DNA fragment의 양이 증가하는 현상을 관찰한 바 있다[17]. 이는 버섯균내 retrotransposon의 활성이 균주의 퇴화와 관련이 있음을 시사하는 것으로, 향후 본 연구를 통하여 발굴된 retrotransposon의 활성과 균주퇴화 간의 상관관계 연구가 필요하다.