서 론
표고버섯은 국내 임산버섯 생산량 중 75%의 비중을 차지하고 있으나 재배 농가들의 56%만이 소득만족도를 보이고 있었다[1]. 이는 상당수의 버섯재배 농가들이 표고버섯 생산에 어려움을 느끼고 있는 것을 나타내며, 국내 버섯의 단위 면적당 생산성의 정체이유를 조사해본 결과 47.9%가 종균의 문제를 들었다[1]. 이러한 단위 면적당 생산성 정체와 관련된 종균의 문제는 종균퇴화가 주된 원인이며 이러한 종균퇴화의 주된 원인은 종균의 노화현상과 바이러스 이병으로 생긴 결과로 사료된다.
곰팡이 바이러스는 환경이 변하거나 기주의 특정 유전자에 돌연변이가 일어나면 병증이 발현되는 것으로 보고되어 있다[2]. 그 대표적인 예가 양송이에서 La France Isomertic Virus (LIV)에 의해 발병한 La France Disease이다[3-6]. 이 병이 발현된 양송이는 자실체의 형태가 외소하며 형성이 늦어질 뿐 아니라 대의 길이가 짧고 갓의 모양이 기형이 되면서 얇아지는 현상이 보고되었으며, 버섯의 분화가 거의 이루어지지 않는 현상도 보고된 바 있다[7]. 이와 같은 바이러스에 의한 병으로 인해 유럽에서 양송이의 전체적인 생산량에 막대한 피해를 보았다[8,9]. 이로 인해 버섯 바이러스의 생활사에 대한 연구가 활발히 이루어졌으며[6,10,11], 그 결과 버섯 바이러스의 전이는 버섯의 균사 접합 과정 중에 일어나는 것을 확인하였다[12]. 양송이뿐만 아니라 느타리버섯, 큰느타리버섯 및 표고버섯에서도 바이러스가 보고되었는데, 느타리버섯에서는 단일가닥의 RNA 바이러스인 Oyster Mushroom Sperical Virus (OMSV)[13]와 이중가닥의 RNA 바이러스인 Oyster Mushroom Isometric Virus (OMIV)[14]가 보고되었으며 이들 바이러스에 감염된 종균에서 바이러스를 퇴치하였을 때(virus-curing) 건전버섯을 생산할 수 있다고 보고되었다[15]. 큰느타리버섯에서도 단일가닥의 RNA 바이러스인 Pleurotus eryngii Sperical Virus (PeSV)[16]가 보고되었다. 표고버섯에서는 이중가닥의 RNA 바이러스인 Lentinula edodes Mycovirus HKB (LeV)[17,18]와 단일가닥의 RNA 바이러스인 Lentinula edodes Spherical Virus (LeSV)[19]가 보고되었다. 보고된 버섯바이러스에 감염된 버섯들은 모두 버섯대가 짧아지고 버섯갓이 찌그러지는 등 버섯 자실체에 기형이 발생하였으며 균사 생장이 불량하였다[14-16].
버섯바이러스는 그 특성상 한번 감염되면 퇴치하기 어려우며 감염 여부를 초기에 진단하기 어려우므로 버섯 농가에서 버섯 바이러스의 피해를 막으려면 바이러스에 감염되지 않은 건전 종균을 선정하는 것이 가장 중요하다. 표고버섯의 경우 2011년 기준으로 국내에서 육성한 품종의 점유율이 20% 수준에 불과하며, 대부분의 종균은 톱밥배지 형태로 중국에서 도입되고 있으며 이들 종균의 수입물량이 계속 증가하고 있는 추세이다[20]. 이러한 형태의 종균은 종균 수입이 아니라 배지 수입의 형식으로 이루어져 버섯 병원균이나 바이러스에 대한 검역이 이루어지지 않고 있는 실정이다. 이에 본 연구실에서는 표고버섯 바이러스인 LeSV와 이 바이러스를 검역하기 위한 RT-PCR primer를 보고한 바 있다[19]. 이 primer를 이용하여 표고버섯의 육종에 사용되는 균주와 재배에 사용되는 균주의 바이러스 감염도를 조사한 결과 각각 78.8%와 72.2%의 감염도를 나타내었다[19]. 이는 국내에서 육종 및 유통되고 있는 균주의 대부분이 바이러스에 감염되어 있음을 나타내는 것이다. 본 연구에서는 앞선 높은 바이러스의 감염도의 원인을 파악하기 위해 무분별하게 수입되고 있는 해외 종균들의 바이러스 감염도를 측정하고자 하였다.
재료 및 방법
사용 균주 및 균주 배양
균주는 버섯균주 및 DNA 은행(Incheon University Mushroom; IUM)에서 해외도입 종균 및 배지형태로 수입된 종균에서 분리한 균사를 분양받아 사용하였고 균사의 배양은 PDA 배지를 이용해 25ºC에서 20일간 이루어졌다.
증폭된 바이러스 DNA 염기서열 분석
RT-PCR을 통해 증폭된 DNA를 T-easy vector (Promega)에 삽입한 뒤 competent cell에 형질전환시켰다. Compe- tent cell을 배양한 뒤 ampicillin을 이용해 형질전환이 이루어진 competent cell을 선택하였고, 선택된 competent cell에서 vector를 분리한 뒤 EcoRⅠ을 이용해 바이러스의 RNA가 증폭된 DNA가 vector에 삽입되었는지 확인하였다. 삽입된 DNA의 염기서열을 분석한 뒤 LeSV의 염기서열과 비교하였다.
결과 및 고찰
해외도입 표고버섯 종균의 LeSV 검출
균사생장 적합 배지 선발
배지의 종류가 균사생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Cz(Czapek Dox, Difco), GPYM(glucose 0.1%, peptone 0.1%, yeast extract 0.1%, malt extract 0.15%), MCM (mushroom complete medium, Difco), MYP(malt extract 0.03%, yeast extract 0.03%, peptone 0.05%), PDA(potato dextrose agar, Difco) 등 5종을 사용하였으며, 균사생장정도는 배지 분주 후 살균한 셀로판지를 배지 위에 깔고 그 위에 균을 접종하여 25ºC에서 12일간 배양하여 균사생장 길이와 생중량을 측정하였다. 액체배지에서는 100 ml 삼각플라스크에 배지를 20 ml씩 분주하여 121ºC에서 20분간 살균하고 균을 접종한 후 25ºC에서 14일간 진탕배양하여 여과지로 여과한 후 50ºC에서 2일간 건조하여 건조중량을 측정하였다.
균사배양 적합 탄소원 및 질소원 선발
Cz배지에서 sucrose 대신에 탄소원을 3%(w/v)첨가하여 121ºC에서 20분간 살균하여 배지를 제조하였다. 탄소원으로 단당류는 glucose, galactose, xylose, fructose 이당류는 maltose, sucrose, lactose 다당류로 starch, malt extract, xylan을 첨가하였다. 질소원은 Cz배지로 해서 NaNO3 대신에 질소원을 0.3%(w/v)첨가하여 배지를 제조하였다. 시험에 사용된 질소원으로 무기태 NaNO2, NaNO3, NH4Cl, NH4NO3, 유기태 yeast extract, peptone, urea, tryptone을 사용하였다.
결과 및 고찰
수집균주의 재배 및 형태적 특성
2013에 Won 등이 보고한 LeSV의 RdRp 유전자의 특이적인 primer 및 RT-PCR 조건[19]을 이용하여 해외 도입 표고균주를 대상으로 바이러스 검출을 수행하였다. 총 89종의 해외도입 표고버섯 균주를 대상으로 실험을 진행하였으며 도입국가는 중국, 대만, 일본, 핀란드, 슬로베니아 및 네덜란드 등이다. 바이러스 유전자의 염기서열에 의하면 LeSV 검출용 primer를 이용해 RT-PCR을 수행하였을 때 LeSV가 존재할 경우 약 400 bp의 DNA가 증폭되어야 하는데[19], 해외 도입 표고균주를 대상으로 바이러스 검출을 수행한 결과 LeSV는 해외도입 표고버섯 균주 88균주 중 87균주에서 약 400 bp의 DNA가 증폭되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 1, 표 1). 증폭된 DNA의 염기서열을 LeSV의 RdRp 유전자와 비교분석한 결과 LeSV의 RdRp 유전자 일부와 증폭된 DNA 염기서열이 일치함을 확인할 수 있었다. 이는 본 연구에서 조사한 해외도입 표고버섯 균주는 거의 모두 LeSV에 감염되어 있음을 나타내는 결과이다.
바이러스에 의한 기형버섯의 발생은 환경에 따라 발생 정도 및 빈도가 다르게 나타난다. 2013년에 Kim 등이 발표한 결과를 보면 L. edodes virus가 감염된 표고균사는 그 생장속도가 느리고 균사 mass가 줄어드는 등 건전 표고균사보다 생장이 불량함을 알 수 있었다[21]. 또한 버섯 바이러스의 전파는 공기나 접촉에 의한 감염이 아니고 병이든 세포와 그렇지 않은 세포간의 접합(fusion)에 의한 것이기 때문에 감염원이 종균일 수밖에 없으며[12], 한번 감염이 되면 퇴치하기가 어렵다. 이러한 이유로 인해 버섯 바이러스 병은 감염 후 퇴치가 아닌 감염을 예방하는 것이 가장 중요하다. 그러나 현재 국내에 유통되는 중국종균은 수입 시 톱밥배지로 수입이 되기에[20] 종균에 대한 바이러스 검역이 이루어지지 않고 있는 실정이다. 하지만 본 연구결과를 보았을 때 해외에서 도입된 균주 중에서도 가장 높은 비율을 차지하고 있는 중국균주가 모두 LeSV에 감염되어 있음을 확인하였다. 이는 국내 버섯의 단위 면적당 생산성의 정체이유 중 하나일 것이며, 바이러스 감염 병증이 나타나지 않고 있는 중국종균 역시 병증발현의 위험성을 내포하고 있는 것을 나타낸다.
