Diversity of Endophytic Fungi Isolated from Leaves of Coniferous Trees on Mt. Minjuji, Korea

김 창균  Chang-Kyun Kim1어 주경  Ju-Kyeong Eo12엄 안흠*  Ahn-Heum* Eom1

Abstract

We investigated the biodiversity of endophytic fungi isolated from leaves of three coniferous species (Pinus densiflora, P. koraiensis, Larix kaempferi) on Mt. Minjuji, Korea. A total of 39 isolates were discovered from 17 host plants and their homology with the ITS region was searched. They were then identified as 22 taxa; 64% of fungal isolates belong to Sordariomyetes, 33% of isolates to Leotiomycetes, and 3% isolates to Agaricomycetes.

Keyword



내생균(endophytic fungi)은 숙주식물에 침투하고 있으면서도 특별한 병증을 나타내지 않는 공생체로써 내생균의 생활사 전체 또는 일부에서 이러한 현상을 보이고 있다[1]. 내생균의 중요성은 날로 증대되고 있음에도 불구하고 아직까지 연구가 매우 미진한 분야라고 할 수 있다. 내생균에 대한 연구는 다양한 분야에서 이루어지고 있는데, 기초적인 동정과 분류학에서부터 이들의 진화적인 의미를 찾는 연구 그리고 인류가 이용할 가능성을 가진 2차 대사산물에 이르기까지 내생균의 연구분야는 매우 다양하다고 말할 수 있다. 내생균은 지형이나 기후 그리고 특이적인 숙주식물의 존재유무에 상관없이 전 세계적으로 분포하는 종이 있는가 하면, 이와는 반대로 지역적으로 고립되어 분포하는 종이 있기도 하다[2]. 현재 약 100만 여 종 이상이 있을 것으로 추정하고 있으며, 이는 연구자마다 상이한 보고를 하고 있다[3,4].

숙주식물 중 한반도에 분포하는 침엽수는 대부분 상록성이며, 도입종과 자생종을 비롯하여 약 54종 정도가 보고되었다[5]. 특히, 기후변화, 침엽수의 산림쇠퇴 등과 같은 부정적인 요인은 전세계적으로 발생하고 있으며, 이로 인해 감소 추세 및 멸종위기에 처한 침엽수와 관련 공생균의 생물다양성에 대한 연구가 매우 요구된다[6]. 국내에서도 내생균의 생물다양성을 규명하고자 하는 연구들이 증가추세에 있으며, 더불어 다양한 숙주식물에서 분리한 연구결과들도 발표되고 있다[7,8]. 따라서 본 연구에서는 충북 민주지산에 서식하고 있는 소나무(Pinusdensiflora Siebold et Zucc.)와 잣나무(P. koraiensis Siebold et Zucc.) 그리고 일본잎갈나무(Larix kaempferi (Lamb.) Carrière)에서 공생하고 있는 내생균을 분리하여 숙주식물에 따른 내생균의 다양성을 확인하고자 하였다.

img/01004202/ksom-42-02-10-g001.jpg

Fig. 1. Phylogenic tree of endophytic fungi from P. densiflora, P. koraiensis and L. kaempferi in Mt. Minjuji. ITS and 5.8S rDNA region were used these sequence analysis to confirm the topological appropriation of isolates. Sphatularia flavida was used as an outgroup.

충북지역의 민주지산(N36°02', E127°50')에서 건강한 소나무 5개체, 잣나무 4개체 그리고 일본잎갈나무 8개체를 선별하여 각 개체에서 소지를 채집하였다. 채집된 소지에서 무작위적으로 침엽을 채취한 후 표면살균과정을 수행하였다. 먼저 이물질을 제거하기 위하여 흐르는 물로 세척한 다음 무균 실험대 내에서 1% 차아산염소산나트륨(NaOCl) 용액에 3분, 70% 에탄올에 2분간 처리한 후, 멸균수로 2회 세척하고 다음 과정을 진행하였다. 그 후 표면 살균된 침엽은 가위를 이용하여 약 5 mm 정도의 길이로 자른 후 PDA 배지에 각각 4개의 절편을 치상하고, 25ºC의 암소에서 배양 후 계대배양을 통해 순수한 균주를 분리하였다[7]. 각각의 내생균은 DNeasy Plant SV mini kit (GeneAll, Korea)의 방법에 따라 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 ITS1F와 ITS4를 이용하여 증폭하였다[9]. PCR은 predena- turation 94ºC에서 5 min 후, denaturation을 94ºC 30 sec, annealing을 50ºC에서 30 sec, elongation을 72ºC에서 1 min을 1cycle로 해서 총 30회를 진행하였으며, 예상되는 크기의 band를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Korea). 분석된 염기서열들은 NCBI 상에서 BLAST한 후, MEGA5[10]를 이용하여 계통수를 작성하였다. 최종적으로 분자생물학적 방법으로 검출된 내생균의 분류군들은 숙주식물에 따른 종 다양성과 분포양상을 분석하였다.

총 17개체의 숙수식물로부터 39개의 균주를 분리하였다. 분리된 균들의 염기서열 분석결과 모두 22개의 그룹으로 나눌 수 있었다(Table 1). BLAST한 결과 NCBI 상의 참고서열들과 유사도가 대부분 99%이상 일치되는 결과를 보여 동일한 분류군으로 간주되었다[11]. 또한 강(class) 수준에서는 크게 3개의 강(Sordariomycetes, Leotiomycetes, Aga- ricomycetes)으로 무리졌으며, 전체는 Sordariomy- cetes가 약 64%, Leotiomycetes가 33%, 그리고 Agarico- mycetes가 약 3%의 비율로 관찰되었다. 즉, 대부분의 내생균이 자낭균에 속하였으며, 소수가 담자균에 속함을 알 수 있었는데, 이와 같은 비율은 선행연구 결과들과 유사한 양상을 띄고 있었다.

Table 1. Molecular identification and the closest taxa of representative isolates using ITS region from P. densiflora, P. koraiensis and L. kaempferi in Mt. Minjuji

img/01004202/ksom-42-02-10-i001.jpg

*Relative abundance indicates the percentages of the number of isolates in the study sites of the total numbers of isolates.

**Frequency indicates the percentages of the number of trees isolated the fungal species of the total number of trees.

충북의 다른 산지에 분포하는 소나무류(Pinus spp.)와 일본잎갈나무에서 내생균을 분리한 결과와 마찬가지로 본 연구에서도 동일하게 소나무류에서만 Lophodermium 속의 종들이 분리되었고, 잎갈나무속에서는 Lophodermium 속의 종들은 발견되지 않았다. 내생균의 분포에 영향을 미치는 요인은 일차적으로 숙주식물의 존재여부이기 때문에 유사한 미기후 상태를 나타낸다고 한다고 하더라도 동일한 숙주식물이 분포하지 않는다면, 숙주식물에 특이적으로 분포하는 내생균에게 필요한 생태적 지위를 만들어 낼 수 없게 된다. 따라서 본 연구결과는 숙주식물과 내생균을 바탕으로 소나무류에 대한 Lophodermium 속의 관계를 생각할 때 추후 후속연구를 통해 종특이적인 균주에 대한 규명뿐만 아니라 다양한 조건에서 이루어지는 배양을 통해 포자 형성을 촉진하고 이에 대한 분류학적인 접근도 요구된다.

일부 균주들(11B012, 11B039, 11C046)에 있어서는 분자적으로 속 수준에서도 종을 확인하기 어려웠으며, 전체적으로 분자 분석을 수행한 내생균의 약 50% 이상에서 ITS 지역만을 통해서는 종 수준에서 명확한 동정이 어려웠다. 그러나, 분지도 상에서 참고서열(reference sequence)과의 비교를 통해서 차지한 각 분류군의 위치는 서로가 다른 분류군임을 확인할 수 있게 해주었으며, 그러한 결과를 바탕으로 분석한 결과 일본잎갈나무에서 가장 높은 종 다양성을 보였다.

대부분 내생균 연구를 통해서 종 다양성이 밝혀진 균들은 일반적인 자연환경에 존재하는 균들로 부생성을 보이거나 숙주식물에 따라 병원성을 보임에도 불구하고, 거의 다 의료적인 관점에서는 인간에게 해를 끼치는 분류군이 매우 드문 편이다. 본 연구에서도 그와 같은 경향성을 볼 수 있는데, 분석된 22개의 분류군 중에서 단지 균주 11C060이 속한 Chaetomium 속만이 인간에서 병원성을 나타내며, 우발적인 감염으로 인체에 감염되는 것으로 보고되었다[12]. 이러한 현상은 다른 연구들과의 비교를 통해 더욱 확인할 필요가 있으며, 의생물학적인 관점의 접근을 통해 내생균 간의 상호작용 및 유용성을 검증할 필요가 있다.

Acknowledgements

이 논문은 2011년도 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2011-0014236).

References

1 Wilson D. Endophyte: The evolution of a term, and clarifica- tion of its use and definition. Oikos 1995;73:274-6. 

2 Saikkonen K, Wali P, Helander M, Faeth SH. Evolution of endophyte-plant symbioses. Trends Plant Sci 2004;9:275-80. 

3  Cannon PF. Diversity of the Phyllachoraceae with special reference to the tropics. In: Hyde KD, editor. Biodiversity of Tropical Microfungi. Hong Kong: Hong Kong University Press; 1997. p. 255-78. 

4  Dreyfuss M, Chapela IH. Potential of fungi in the discovery of novel, low-molecular weight pharmaceuticals. Biotechno- logy (Reading, Mass) 1994;26:49-80. 

5 Lee TB. Gymnosperms in Korea. Bull Kwanak Arbor 1983;4: 1-22. 

6 Kong WS. Biogeography of Native Korean Pinaceae. J Kor Geogr Soc 2006;41:73-93. 

7  Eo JK, Kim CK, Lee HB, Eom AH. Diversity of Endophytic Fungi Isolated from Pinus densiflora and Larix kaempferi in Mt. Oser, Korea. Kor J Mycol 2013;41:137-41. 

8 Kim CK, Eo JK, Eom AH. Diversity fo Foilar Endophytic Fungi Isolated from Lindera obtusiloba in Korea. Kor J Mycol 2012;40:136-40. 

9 Gardes M, Bruns T. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycor- rhizae and rusts. Mol Ecol 1993;2:113-8. 

10 Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol 2011;28:2731-9. 

11 Arnold AE. Understanding the diversity of foliar endophytic fungi: progress, challenges, and frontiers. Fungal Biol Rev 2007;21:51-66. 

12 Campbell CK, Johnson EM. Identification of pathogenic fungi. 2nd ed. London: John Wiley & Sons; 2013.