Diversity, Saccharification Capacity, and Toxigenicity Analyses of Fungal Isolates in Nuruk

누룩의 수집 및 곰팡이 분리

전국의 양조장, 누룩제조사 및 재래시장 등에서 11종의 누룩을 수집하였다. 누룩에 생육하는 곰팡이를 분리하기 위하여, 수집한 누룩 1 g을 파쇄하여 10 mL의 멸균수에 현탁시킨 후, 상등액을 1/10000로 희석하여 potato dextroseagar(PDA; Ventech Bio Co., Eumseong, Korea)와 DRBCagar(동물조직 효소분해물 5 g/L, 포도당 10 g/L, KH₂PO₄1 g/L, MgSO₄ 0.5 g/L, Rose Bengal 0.025 g/L, dichloran0.002 g/L, chloramphenicol 0.1 g/L, agar 15 g/L, pH 5.6)에도말하고 30ºC에서 3~4일간 배양한 후 단일 콜로니를 PDA배지로 옮겨 순수분리를 하였다. 분리된 곰팡이들과의 비교분석을 위하여, 농촌진흥청 발효식품과에서 보유한 A.oryzae 7종(82-7, SS1, 59-5, 83-3, 78-5, 40-2, 82-3), A. luchuensis2종(74-5, 34-1), R. oryzae 6종(26-4, CN084, CN105, CN174, 58-11)을, aflatoxin 생산능 비교를 위해서는A. flavus KCCM11910, KCCM60330 균주와 A. parasiticusKCCM12699, KCCM12701, KCCM35079 균주를 각각 분양받아 사용하였다.

18S rDNA 및 ITS 염기서열분석

분리된 각 곰팡이의 부분동정을 위하여 18S rDNA 및 ITS 염기서열을 분석하였다. 18S rDNA는 NS1 (5'-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3')과 NS8 (5'-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3')을 이용하여 PCR로 증폭하였으며[16], ITS는 NSA3 (5'-AAA CTC TGT CGT GCTGGG GAT A-3')와 NLB4 (5'-GGA TTC TCA CCC TCTATG AC-3')를 이용하여 증폭하였다. PCR 및 genomic DNA 추출은 이전에 보고된 방법을 사용하였다[17]. 증폭된 PCR 산물은정된 염기서열의 Blast 분석을 통하여 해당 곰팡이의 부동정을 실시하였다.

Amylase 및 β-glucanase 효소활성의 측정

Amylase 활성 측정을 위하여 각 곰팡이 균주들을 starch(Bio Basic Canada Inc., Ontario, Canada)와 beef extract(BD, MD, USA)가 각각 10 g/L, 3 g/L 포함된 5 mL starchbroth에 30ºC, 48시간 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 잔여 전분과 균사를 가라앉히고 상등액을 취하였다. 상등액 20 μL에 물 180 μL를 가한후 30mM phosphate buffered saline (PBS, pH 6)에 녹인starch(1 g/L) 200 μL를 섞고 30ºC에서 20분간 반응시켰다.반응 후 유리된 환원당을 DNS 방법[18]으로 정량하여amylase의 활성을 측정하였다. β-glucanase 활성 또한 위상등액을 사용하여 측정하였다. 이를 위하여 상등액 20 μL에 물 180 μL를 가한 후, 100 mM sodium actate (pH 5.0)에 녹인 β-glucan (1 g/L) 200 μL를 섞고 30ºC에서 30분간반응시켰다. 반응 후 유리된 환원당을 DNS 방법으로 정량하여 β-glucanase의 활성으로 환산하였다. 각 효소의 활성1 unit은 1분당 1 μ의 포도당을 만드는데 필요한 효소량으로 정의하였다.

Aflatoxin 생합성 유전자 분석

각 균주들에서 aflatoxin 생산에 관여하는 유전자들의 존 재 여부를 확인하기 위하여 norB-cypA, omtA, aflR에 대응 하는 primer들을 제작하여 PCR을 수행하였다. norB-cypA 영역의 증폭에는 AP1729 (5'-GTG CCC AGC ATC TTG GTC CAC C-3')와 AP3551 (5'-AAG GAC TTG ATG ATT CCT C-3') primer를 사용하였다[14]. omtA의 증폭은 forward primer, 5'-CAG GAT ATC ATT GTG GAC GG-3'와 reverse primer, 5'-CTC CTC TAC CAG TGG CTT CG-3'를 사용하였고[10], aflR은 F2 (5'-CCG GCG CAT AAC ACG TAC TC-3')와 R2 (5'-GGC GCT TGG CCA ATA GGT TC-3')를 사용하였다[11].

Aflatoxin 생합성 유전자 분석

각 균주를 aflatoxin 생산이 유도되는 YES 배지(sucrose 60 g/L, yeast extract 20 g/L)[19] 10 mL에 분주하고 shaking incubator에서 180 rpm, 30ºC, 암실 조건으로 120시간 동안 배양하였다. 배양완료 후 배양액 1 mL에 chloroform 0.1 mL을 가하여 aflatoxin 추출하였다. 추출액 내 aflatoxin 을 TLC plate (Silica gel 60 F254; Merck Co., USA)상에서 diethylether-methanol-water(96:3:1)를 이동상으로 사용하 여 20분간 전개하여 분석하였다.

결과 및 고찰

누룩의 수집 및 누룩 곰팡이 분리

누룩에 포함된 다양한 종류의 유용 곰팡이 균주를 분리를 위하여 양조장, 누룩제조사, 재래시장 등에서 11종의 누룩을 수집하였다(Table 1, MS1~11). 수집된 누룩으로부터곰팡이를 분리하기 위하여, 누룩 현탁액을 DRBC 고체배지에 도말하여 25ºC에서 5일간 배양하였다. 배양결과 대부분의 누룩에서 효모들이 우점하는 것으로 관찰되었으며,MS2, MS5, MS11 누룩만이 균사상 곰팡이들이 우점하고있었다(Fig. 1, Table 1). 각 고체배지내 곰팡이균들의 수를 콜로니형성단위(CFU)로 측정한 결과, MS4, MS8, MS10 등 3종의 누룩에서 각각 1,278.9±21.6 (×10⁴), 1,868.0±27.7 (×10⁴), 775.1±19.2 (×10⁴) CFU (20 mg 누룩당)로 가장 높은 곰팡이균 밀도를 보였으며, 이들의 대부분은 효모균으로 밝혀졌다. 이와 관련하여 최근 연구의 다른 연구에서는 누룩 10 g당 10⁶~10⁸ 콜로니형성단위(colony forming unit,CFU)의 곰팡이와 10⁴ CFU 내외의 효모균이 포함되어 있는 것으로 보고되었다[1]. 본 연구의 결과를 누룩 10 g 당곰팡이균 수로 환산하면 10⁸~10⁹의 CFU로 기존 연구결과와 유사하다 할 수 있으나, 효모균의 수가 압도적으로 많다는 측면에서는 기존 연구와 차이 나는 결과이다. 차이의원인은 분리에 사용된 배지에서 기인하는 것으로, PDA 배지나 yeast mold agar+chloramphenicol 배지[1]는 곰팡이의 성장에 유리하여 상대적으로 효모균의 성장이 억제되나,DRBC 배지는 곰팡이의 성장을 억제시켜서 효모의 성장을 상대적으로 부각시켜주는 배지이다[20, 21]. 한편, MS3 누룩은 7.6±0.4 (×10⁴) CFU로서 가장 작은 수의 곰팡이균을가지고 있었다. 곰팡이균의 다양성 측면에서는 MS7을 제외한 대부분의 누룩에서 5종 내외의 곰팡이들이 발견되었다. 이상의 결과는 누룩이 제조지역 및 사용원료에 따라 다양한 곰팡이균을 다양한 비율로 포함하고 있음을 알려 주는 것이다.

누룩곰팡이균의 분리 및 ITS, 18S rDNA 서열분석을 통한 동정

고체배지에서 생육한 곰팡이들 중 콜로니의 모양과 크기, 균사의 형태, 포자의 색깔 등 형태학적 특징들이 구분되는 각각의 콜로니를 분리하여 PDA 배지에서 배양하였다. 분 리된 각 곰팡이균의 부분동정을 위하여, 18S rDNA 및 ITS 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 BLAST로 검색 하여 각 곰팡이를 동정하였다. 그 결과, 대부분의 누룩에서 주요 우점균으로 관찰된 효모균들은 P. anomala, P. kudriavzevii, Kluyveromyces marxianus와 이형성 효모(dimorphic yeast)인 Saccharomycopsis fibuligera임이 밝혀졌다. P. kudriavzevii는 ethanol 발효능이 우수한 효모균으로 바이 오매스 자원으로부터 동시당화발효를 통한 ethanol 생산 연구가 진행되고 있는 대표적인 균주이다[22-24]. P. kudriavzevii는 일반 효모와 달리 균의 모양이 길쭉하며, 경우 에 따라서는 세포질이 연결된 위균사(pseudohyphae)를 만 들기도 한다(Fig. 2) S. fibuligera는 이형성 효모로서 콜로 니의 내부에는 효모형 균체가 다수 관찰되나 가장자리 부분에서는 균사상으로 자라는 것을 관찰하였다(Fig. 2). 전분 의 당화관련 효소를 분비생산하는 능력이 우수한 균으로 많은 연구결과가 보고되어 있다[25, 26]. K. marxianus는 다 양한 종류의 효소를 분비하며, 여러가지 향기성분을 생산 하여 발효식품에 풍미를 더하는 효모이면서 고온에서 알코 올발효하는 특성을 가지고 있다[27]. P. anomala는 특이하 게 산소제한조건에서만 알코올을 발효하는 특징을 가지고 있다[28]. 또한 곰팡이를 죽이는 능력이 뛰어나 A. flavus 같은 유해균의 생물학적 방제제로도 연구되고 있다[29]. 실제로 P. anomala가 우점하는 누룩의 경우에는 균사상곰 팡이의 성장이 극도로 억제됨을 확인할 수 있다(Fig. 1). 곰팡이로는 접합균류에 속하는 R. oryzae와 자낭균류에 속하는 A. oryzae가 주로 검출되었다(Table 1). R. oryzae와 A. oryzae는 동양에서 전통적으로 발효식품에 사용되어 온 대표적인 당화용 곰팡이이다. 접합균류인 A. corymbifera 6개의 누룩에서 각각 발견되어 이들 또한 누룩을 이루는 주 요 곰팡이임을 알 수 있었다. 이외에도 A. fumigatus, M. indicus, Trichosporon loubieri 등이 특정 누룩에서 발견되 었다. MS6 누룩에서는 Paecilomyces varotii가 발견되었는 데 이는 다른 연구에서도 보고된 바 있다[30]. 한편, 경북 청도지역에서 수집한 누룩(MS7)에서는 곰팡이로 흑국균인 A. niger만이 분리되었다. 분리된 대표적인 곰팡이 및 효모들은 Fig. 2에 나타내었다.

누룩분리 곰팡이의 배양액의 amylase, β-glucanase, esterase효소활성

누룩은 전통주 생산과정에서 전분을 분해하여 당화하는 기능을 수행할 뿐 아니라, 발효주의 맛과 향을 좌우하는 성 분을 제공한다. 누룩의 이러한 기능과 관련하여 누룩분리 곰팡이가 분비·생산하는 당화효소인 amylase와 휘발성 향 기성분 생산에 관련된 esterase, 누룩원료인 밀에 포함된 β- glucan을 β-glucanase 효소활성을 조사하였다. 이를 위하여 각각의 곰팡이를 전분배지에서 25ºC에서 5일간 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 효소조액으로 사용하였 다. 곰팡이 배양액의 각 효소활성은 Fig. 3에 나타내었다. p- Nitrophenylbutyrate를 이용한 esterase 활성은 대부분의 곰 팡이 배양액에서 유사하게 나타났다. Amylase 활성은 A. niger와 A. luchuensis가 가장 높은 것 으로 나타났다. 이들 균주는 주로 막걸리제조에 사용되어 왔던 균들로서, 모두 A. niger clade에 속하는 균들이다[31]. A. niger clade 다음으로 당화능이 높은 곰팡이는 S. fibuligera로서 α-amylase, glucoamylase 등 당화효소를 분비생산 하는 것으로 알려져 있으며[25, 26, 32], 높은 당화능력으로 인하여 카사바와 같은 전분이 많이 함유된 작물의 당화에 활용되고 있다[33]. A. oryzae 와 R. oryzae는 누룩이나 메 주와 같은 전통발효식품에서 주로 발견되는 곰팡이균으로 서, 특히 누룩에서는 주요 당화균이다[1]. 그러나, 당화능력 에서는 앞서 소개된 3가지 곰팡이균에 미치지 못하고 있다. 한편, A. corymbifera, P. kudriavzevii를 포함하는 기타 수종 의 곰팡이들 또한 관찰되었으나, 이들의 당화능은 매우 낮 아서 전분의 당화 측면에서 큰 기능은 하지 않는 것으로 판 단되었다. Pichia spp.는 ethanol 발효능이 뛰어난 효모이므 로 전분의 당화 후 알코올 생산에 기여할 것으로 생각된다. 누룩의 제조에 사용되는 곡물에는 다량의 비수용성 β- glucan이 포함되어 있다[34]. 이러한 비수용성 β-glucan을 적절히 분해하여 가용화하면, 누룩을 이용하여 만든 막걸 리에 면역활성을 높여주는 기능성을 부여할 수 있다. 따라 서 누룩곰팡이의 β-glucan 분해능을 확인하기 위하여 배양 액내 β-glucanase 활성을 조사하였다. 그 결과 β-glucanase 활성은 일부 A. oryzae 균에서 소량 관찰되었으나, 주요활성 은 R. oryzae의 배양액에서 관찰되었다(Fig. 3B). 농촌진흥 청 분리균주인 CN105균주가 가장 활성이 높았으며, 본 연 구에서 분리된 MS2-1, MS2-2 균주도 높은 활성을 보였다.

Aspergillus oryzae의 Aflatoxin 생산능 조사

누룩에 존재하는 주요 곰팡이균인 A. oryzae는 aflatoxin 생산균인 A. flavus와 유전적으로 근연한 종이므로[10], 분 리된 A. oryzae균들의 aflatoxin 생산여부를 조사하였다. 먼 저 본 연구에서는 norB-cypA, aflR 및 생합성 경로상에 존 재하는 omtA 유전자 부위를 PCR로 조사하였다. 그 결과 omtA 유전자는 모든 A. oryzae 분리균주들 및 A. flavus (KCCM11910, KCCM60330), A. parasiticus (KCCM12699, KCCM12701, KCCM35079)에서 발결되었으나, A. oryzae/ flavus clade에 속하지 않는 A. fumigatus (MS4-6), A. niger (MS7-1), A. luchuensis (74-5, 34-1) 등에서는 발견되지 않 았다(Fig. 4A). aflR 유전자의 경우에도 종종 deletion이 관 찰되는데[15], 본 연구에서도 MS1-5, MS2-5를 포함하는 9 종의 분리균주와 농촌진흥청 분리균주인 83-3, 40-2 등 두 종의 A. oryzae 균주에서 aflR 유전자의 deletion이 확인되 었다(Fig. 4A). 한편 norB-cypA 영역을 조사한 결과, 대조균주인 A. parasiticus (KCCM12699, KCCM12701, KCCM 35079)에서는 1.8 kb길이의 완전한 PCR 산물이 만들어졌 다. 또, 대조균주 A. flavus KCCM11910과 KCCM60330 균 주는 각각 0.3 kb, 0.8 kb 길이의 norB-cypA 영역을 나타내 어 각각 Type I, Type II deletion 균주임을 알 수 있었다 (Fig. 4A). 반면 MS2-15, MS9-13를 제외한 모든 분리균주 에서 norB-cypA 영역이 검출되지 않았으며, 이러한 결과를 보이는 균주들에서는 aflR 유전자도 deletion되어 있었다. 이렇게 aflR 유전자의 deletion이 norB-cypA 영역의 deletion과 동반하는 경우가 최근 연구에서 보고되어 있지만 그 원인은 아직 규명되지 않았다[15]. 이상의 결과는 분리된 모든 균주들이 aflatoxin을 생산하지 않는 균주들임을 시사 하고 있다. 이는 aflatoxin 생산 유도배지에서 배양한 각 균 주들의 상등액을 TLC로 분석한 결과와도 일치하는 것이 다. Fig. 4B의 TLC 결과 A. parasiticus 균주들 만이 aflatoxin들을 생산하고 있으며, Type I, II deletion의 A. flavus 균주를 포함한 모든 균주들이 non-alatoxigenic 균주임을 알 수 있다. 결론적으로, 국내 여러지역 및 생산경로를 통하여 수집 된 누룩내 곰팡이의 함량 및 다양성을 조사한 결과 누룩의 제조원에 따라 곰팡이 함량과 다양성이 크게 차이나는 결 과를 보였으며, 이는 누룩을 이용한 전통주의 품질 및 발효 효율에 크게 영향을 미칠 것으로 판단되었다. 본 연구에서 는 특히 다수의 누룩에서 주요우점균으로 이형성효모인 S. fibuligera이 반복적으로 발견되고, S. fibuligera 균이 높은 당화능을 보임에 따라, 누룩에 포함된 주요 당화균으로 기 존의 R. oryzae와 A. oryzae에 더하여 S. fibuligera가 주요 한 역할을 할 가능성이 제기되었다. 다행히도 본 연구에서 분리된 A. oryzae에 균은 모두 aflatoxin을 생산하지 않는 안전한 균으로 밝혀졌다. 향후 누룩의 성능과 품질의 유지 를 위해서는 누룩 곰팡이균 및 효모의 분리와 동정, 누룩 분리 곰팡이의 적절한 배합비율, 누룩성분에 따른 곰팡이 의 천이에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 판단된다.