Biological Control of Lettuce Sclerotinia Rot by Bacillus subtilis GG95

이 현주  Hyun-Ju Lee1김 진영  Jin-Young Kim2이 진구  Jin-Gu Lee2홍 순성  Soon-Sung Hong3

Abstract

Sclerotinia sclerotiorum, a plant pathogenic fungus, can cause serious yield and quality losses in the winter lettuce field. For biological control of S. sclerotiorum, soil-born microorganisms that inhibit the mycelia growth of S. sclerotiorum and Fusarium oxysporum were isolated from diseased soil. Among the isolates, bacterial isolate, GG95, which was identified as Bacillus subtilis according to the morphological, physiological characteristics and by 16S rRNA similarity, showed the highest level of inhi- bitory activity. The growth conditions for B. subtilis GG95 were optimized in TSB media (pH 7) by culturing at 28ºC for 24 hrs. Maltose or fructose and peptone were selected as the best carbon and nitrogen sources, respectively. Greenhouse experiment was performed to test effectiveness of B. subtilis GG95 in the control sclerotinia rot. Drench application (1 × 108 cfu/ml, 3 times) of the bacterial culture broth to lettuce showed an effectiveness value of 88%, suggesting that B. subtilis GG95 would be a promising biocontrol agent for control of sclerotinia rot.

Keyword



서 론

상추에 발생하는 병은 약 28종이 국내에 보고되어 있으며[1], 그 중 Sclerotinia sclerotiorum에 의한 균핵병(sclero- tinia rot)은 다범성균으로 64과 225속 383종의 식물을 침해하고[2], 특히 겨울철 저온 다습한 환경에서 발생이 심하며 기주 범위가 매우 넓어 상추 뿐만 아니라 거의 모든 채소작물에 발생하며 경제적 피해가 심각하다[3-5]. 이러한 균핵병 등의 토양병해를 방제하기 위해 지금까지 농가에서는 프로파, 베노밀 등의 다양한 화학농약을 살포하고 있으나 그 효과가 크지 않고, 인축에 대한 독성과 잔류농약에 대한 환경오염 등의 화학적 방제의 문제를 해결하기 위한 대체수단이 절실히 요구되고 있다. 그 해결책으로 친환경 또는 유기농자재를 이용하는 생물학적 방제가 시도되고 있다[4, 6-8]. 특히 생물적 방제를 위해서 외국에서는 Coniothytium minitans [9], Trichoderma viride [10] 등 길항균을 이용한 균핵병 방제가 보고된 바 있으며, 우리나라에서도 다양한 길항균을 이용한 생물적 방제에 대한 시도가 이루어지고 있다[11, 12].

본 연구는 상추 연작 재배지에서 심한 피해를 주고 있는 문제 병해인 균핵병과 시들음병(Fusarium wilt)을 대상으로 친환경 및 유기재배 농가에서 농약을 대체 사용할 수 있는 미생물 방제제를 개발하기 위하여, 시설재배 상추의 근권 토양에서 미생물을 분리, 길항미생물을 선발, 동정하고 생물적 방제 가능성을 탐색하고자 수행하였다.

재료방법

발병조사 및 병원균 분리

경기도 내 주요 시설채소 재배지역인 고양, 용인, 이천 등을 중심으로 2009년 1월부터 균핵병과 시들음병 발생율을 조사하였다. 겨울철에는 균핵병이 발생한 상추를 채취하고, 여름철에는 시들음병 병징을 보이는 상추의 뿌리를 채취하여 병든 조직 또는 균사 및 균핵으로부터 균행병을 분리하였고, 시들음병균은 감염된 뿌리의 절편을 분리하여 1% sodium hypochloride, 70% EtOH에 약 1분간 표면살균 후 멸균수로 세척하여 potato dextrose agar(PDA, BD Co., Sparks, MD) 평판배지 위에 놓고 25ºC, 암조건 하에서 2일간 배양하였다. 평판배지에서 자라는 균사절편을 PDA 평판배지에 2~3회 반복 이식하여 병원균을 순수 분리하였다. 순수 분리된 병원균은 4ºC 저온 배양기에 보존하면서 실험에 이용하였다.

길항미생물 분리 및 선발

경기도 내 주요 시설재배 포장에서 근권부위 토양을 채취하여 10 g의 토양을 살균수 90 mL과 혼합하고, 1 mL을 채취하여 9 mL 멸균수에 차례대로 희석한 후 nutrient agar (NA, BD co.)배지에 100 μ L씩 평판희석법으로 25ºC에서 3일 이상 배양하였다. 이후 생성된 다양한 콜로니에서 분리한 220균주를 대상으로, 수집 및 분리해 보관 중인 상추 균핵병균 S. sclerotiorum와 시들음병균 Fusarium oxysporum에 대하여 7일 이상 25ºC에서 대치배양 후 형성되는 병원균의 균사생육 저지대를 조사하여 길항력이 높은 균주를 선발하였다.

길항미생물 동정

상추의 균핵병과 시들음병에 대해 모두 길항력을 가진 미생물 균주의 생화학적 특성은 세균동정기 Vitek 2 com- pact(BioMrieux, Inc., Hazelwood, MO)의 BCL카드를 이용하여 조사하였고, 16s rRNA 염기서열 분석을 통해 NCBI blast 검색으로 유전적 동정을 하였으며, 형태적 확인을 위해 주사전자현미경(HITACHI S-3000)으로 관찰하였다.

길항미생물 최적배양 조건

선발된 길항미생물에 대한 적정 배양조건 확인을 위해 온도범위 5oC 간격으로 10~35ºC 사이에서 180 rpm 24시간 배양 후 분광광도계에서 OD 600 nm에서 값을 측정하였고, pH는 pH 3~8 사이에서 pH 1 간격으로 조사하였다. 적정한 영양원을 선발하기 위해 최소배지(K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.2%, glucose 0.5%, (NH4)2SO4 0.1%, MgSO47H2O 0.01%)에 탄소원을 결정하기 위해 glucose를 제외하고 sucrose 등 각각의 탄소원을 전체용액에 1% 농도로 첨가하여 25ºC, 180 rpm으로 24시간 배양 후 배양정도와 균핵병균과 시들음병균에 대치 배양하여 항균활성을 측정하였다. 질소원은 최소배지에서 (NH4)2SO4 0.1% 대신 peptone 등 질소원을 0.5%씩 첨가하여 배양정도와 항균활성을 조사하였다. 무기염류는 최소배지에서 무기염류인 K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.2%, MgSO47H2O 0.01% 대신 MgCl2등 각각의 무기염류를 5 mM씩 첨가하여 길항미생물의 배양과 항균활성을 비교하였다.

길항균의 균핵병에 대한 포장내 예방효과

비닐하우스에 상추를 정식한 후 포장 내 토양에 25ºC, 180 rpm으로 TSB배지에서 24시간 배양한 길항미생물 배양액을 1 × 108 cfu/mL 농도로 포기당 10 mL씩 일주일 간격으로 3회 관주하였다. 그 후 상추 균핵병에서 분리한 병원균을 15ºC PDA 배지에서 2주 이상 배양하여 형성된 균핵을 상추 포기당 3개씩 뿌리 부분의 토양 속에 5 cm 깊이로 접종하고, 1주 후부터 균핵병의 발병정도를 조사하면서 6주 후의 방제가를 조사하였다.

결과 및 고찰

발병조사 및 병원균 분리

경기도 내 시설채소 재배지역에서 발병되는 토양병의 발병율을 조사한 결과 균핵병은 10월부터 발생되기 시작하여 이듬해 5월까지 계속 병 발생이 관찰되었으며 12월경 이천의 재배농가에서는 40%까지 병이 발생하여 피해가 심각한 포장도 있었다. 한편, 상추 시들음병은 연작 재배한 시설 하우스에서는 3월부터 발생되기 시작하여 9월까지 꾸준히 발생하였으며, 기온이 높은 여름철엔 최대 95%까지 발생하여 큰 피해를 주었다(Table 1). 균핵병의 병징을 관찰한 결과, 상추의 지제부와 잎에 수침상의 병반이 형성되어 갈색내지 흑갈색으로 변하다가, 습도가 높아지면서 발병부위의 무름 증상이 심해지고, 흰색 균사가 덮이면서 식물체 전체가 고사하고 잎은 종잇장처럼 마르기도 하며, 균사와 함께 흑색의 균핵이 형성되었다. 이는 Baek 등[13]이 보고한 수침상의 담갈색 병반을 나타내고, 흰색 솜모양의 균사가 자란 후 검고 둥근 균핵이 형성된다는 결구상추의 균핵병 증상과도 유사하였다. Fusarium균에 의한 시들음병은 김 등[14]이 보고한 바와 같이 생육이 저조하고 포기 전체가 위축되며 하엽이 황화되는 증상을 보이며 줄기 기부를 절단해보면 도관부가 원형으로 갈변되는 증상을 보였다. 본 시험에 사용된 병원균은 조사지역에서 위와 같은 병징을 보이는 식물체에서 분리된 균핵병균과 시들음병균을 이용하였다.

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길항미생물 분리 및 선발

분리된 균핵병균과 시들음병균에 대해 상추 재배지 토양에서 분리한 220균주를 대상으로 PDA 배지에서 1주일간 대치 배양을 통해 균사생육 억제효과가 좋은 균주 5종을 1차 선발하였다(Table 2). 그 중 두 병원균에 대해 모두 12 mm 이상의 저지대를 형성하며 길항효과를 보인 GG95 균주를 최종 선발하였다(Fig 1(B)).

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Fig. 1. Scanning electron microscope image of B. subtilis GG 95 (A) and inhibitory effects of B. subtilis GG95 against Sclerotinia sclerotiorum (left) and Fusarium oxysporum (right) (B).

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Fig. 2. Effects of temperature (A) and pH (B) on the growth of B. subtilis GG95.

길항미생물 동정

상추의 균핵병과 시들음병에 대해 길항력을 가진 GG95 균주를 16s rRNA 염기서열 분석을 통해 NCBI blast 검색으로 유전적 동정한 결과 Bacillus subtilis strains와 99%의 상동성을 보였으며, 전자현미경 검경결과 간균 형태로 전형적인 바실러스 모양이었다(Fig 1(A)). 생화학적 특성검사를 위한 VITEK compact의 BCL 카드의 검정결과 김 등[15]과 같이 phenylalanine 음성반응과 mannose, glucose, mannitol, xylosidase에 양성반응 등 유사한 생화학적 반응을 보임으로 B. subtilis strains으로 동정되었다(Table 3). 이에 분리된 동정균을 B. subtilis GG95로 명명하였다. Han- delsman 등[16]은 Bacillus 속균은 내생 포자를 형성하여 내열성과 내건성 특성을 가져 제형화에 많은 장점을 가지고 있다고 하였으며, 이에 선발한 B. subtilis GG95도 식물 병원균에 대한 생물학적 방제에 유용할 것으로 생각된다.

길항미생물 최적배양 조건

B. subtilis GG95에 대한 배양적 특성을 조사한 결과 Fig 3과 같이 배양온도 25ºC에서 600 nm 흡광도 1.0으로 배양이 가장 우수하였으며 그 이상의 온도에서는 균 배양에 대한 흡광도가 떨어지는 것으로 나타나 35ºC 이상의 고온배양은 피해야 할 것으로 판단된다. 적정한 배양 산도는 pH 7에서 흡광도 1.0으로 가장 잘 배양이 되었으며, pH 6이하에서는 급격히 배양이 떨어지는 것으로 나타났다(Fig 2). 김 등[14]은 25ºC에서 균의 생장이 가장 높았으며 항진균 물질 생산은 25~30ºC에서 가장 높았다는 결과와 유사하였으나 최적 pH는 4.5~9.5로 그 범위가 넓어 pH 6 이상에서 배양이 되는 본 연구와 차이가 있었다.

B. subtilis GG95 배양에 적정한 영양원은 전분을 탄소원으로 이용하였을 경우 배양이 가장 잘 되었으나 탄소원별 병원균에 대한 억제력은 균핵병에는 fructose, 시들음병에는 maltose를 탄소원으로 이용하였을 경우 억제대가 각각 8.5와 9.0 mm 이상으로 가장 크게 나타났다(Table 3). Table 4는 선발균에 대해 tryptone과 peptone을 질소원으로 이용하였을 때 배양이 가장 잘 되었으며, 질소원별 병원균에 대한 억제력은 peptone을 이용하였을 때 균핵병에 대한 억제대가 13 mm, 시들음병균에 대한 억제대는 tryptone 이용한 경우 7.5 mm로 억제대가 가장 좋았다. 이는 최적 탄소원으로 fructose, 질소원으로 peptone, yeast extract 결과를 얻은 정 등[17]의 결과와 비슷하였다.

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무기염류의 경우 Table 5와 같이 MgCl2를 배지의 영양원으로 이용하였을 때 흡광도 1.0 이상으로 균의 배양이 잘 되었고 균핵병에 대한 억제력은 CaCl2를 이용하였을 경우 억제대가 10.0 mm로 가장 크게 나타났으며, 시들음병균에 대한 억제력은 대체로 낮은 편이었으나 MgSO47H2O을 이용한 경우 5.0 mm로 가장 억제대가 크게 나타났다.

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Fig. 3. Effect of B. subtilis GG95 on sclerotinia rot in the greenhouse.

길항균의 균핵병에 대한 포장내 예방효과

상추재배시 문제가 되고 있는 균핵병과 시들음병에 대한 미생물 방제제 개발을 위하여 병해가 발생된 상추 포장에서 미생물을 분리하고, 길항미생물을 선발하여 균의 특성을 조사하고 균핵병에 대한 예방효과를 검정한 결과는 다음과 같다. 경기도 주요 상추 재배지에서 균핵병은 10월부터 발생하여 다음해 5월까지 발생하였으며, 12월에는 최대 40%까지 발생하여 피해를 주고 있었다. 균핵병과 시들음병에 모두 억제효과가 있는 균주를 대치배양을 통해 선발하였다. 선발됨 균주는 Vitek 2의 BCL카드를 이용한 생화학적반응과 형태적 확인, 16s rRNA 분석을 통해 동정한 결과 Bacillus subtilis로 동정되었고 B. subtilis GG95로 명명하였다. B. subtilis GG95의 배양특성을 조사한 결과 온도 25~ 30oC, 산도 7의 배양조건에서 배양이 잘 되었으며, 배양에 적정한 영양원은 탄소원 전분, 질소원 tryptone과 yeast extract를 무기염류 MgCl2를 사용하였을 때 가장 잘 되었다. 영양원에 따라 균핵병과 시들음병에 대한 길항효과가 좋은 탄소원은 fructose, maltose였고 질소원은 peptone였으며, 무기염류는 균핵병은 CaCl2, K2HPO4, 시들음병은 MgSO47H2O로 병원균에 대한 길항효과가 차이가 있었다. 상추 균핵병에 대한 B. subtilis GG95의 포장검정 결과 1 × 108 cfu/mL 농도의 길항미생물 배양액을 포기당 10 mL씩 3회 관주하고 균핵병원균을 접종한 후 균핵병의 발병정도를 조사한 결과 88% 방제효과가 나타났다.

적요

P. tolaasii에 의해 발생하는 세균갈색무늬병은 버섯재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균갈색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 느타리 폐면배지와 양송이 퇴비에서 세균갈색무늬병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC5를 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC5균주는 P. azotoformans로 동정되었다. P. azotoformans HC5를 양송이, 팽이버섯, 느타리에 처리한 결과 각각 78%, 73%, 71%의 방제효과를 보였다. 따라서 P. azotoformans HC5가 버섯 세균갈색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다.

Acknowledgements

본 연구는 농촌진흥청 기관고유 연구과제(PJ0099610120 14)에 의하여 수행된 연구결과입니다.

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