서 론
수지상균근(arbuscular mycorrhizas)은 식물과 균류 사이의 공생 관계에 있어서 가장 대표적인 형태 가운데 하나이다[1]. 수지상균근을 형성하는 균은 모두 Glomeromy- cota 문에 속하는 것으로 알려져 있으며, 전 세계적으로 현재 240여종의 수지상균근균이 기록되어 있으나 현재까지 국내에서는 90여종이 보고되었다. 그러나 그 중 대부분은 야외 토양에서 추출한 포자의 형태적 특징을 이용하여 종을 동정하였다. 수지상균근균의 형태적 동정에 이용할 수 있는 형질의 수가 많지 않고, 형질의 특징이 불분명하기 때문에 포자의 형태를 이용한 종 수준의 동정에는 많은 어려움이 있다. 특히 야외 토양에서 수집한 포자는 대부분 포자의 외관이 손상되어 형태적 특징을 뚜렷하게 관찰하기 어려워 과거에 보고된 국내 수지상균근균에 관해서는 배양체를 통한 형태적, 분자생물학적 동정 결과가 보완되어야 할 것으로 보인다. 그러나 수지상균근균은 식물과의 공생 관계를 통해서만 생장이 가능하기 때문에 현재까지 이 균의 단독 배양이 불가능한 점도 수지상균근균의 연구의 제한점이다. 그러나 생태계에서 수지상균근균의 역할과 생태적 중요성을 생각해 볼 때, 토양의 중요 미생물인 수지상균근균을 수집하고 배양하여 순수 균주를 확보하는 것은 수지상균근균의 생물적 특성을 파악할 뿐만 아니라 식물과 수지상균근균의 공생 관계를 이해하는데도 중요한 과제이다. 본 연구에서는 우리나라의 다양한 지역으로부터 식물근권에서 토양을 수집하여 식물과 함께 배양한 후, 5속 8종의 형태적 특징을 기재하고 분자생물학적 종 동정을 수행하였다.
재료 및 방법
토양채취 및 배양
근권 토양의 수집은 경상북도과 충청남도 지역에서 수행하였다. 채집지역에서 다양한 기주식물과 기주식물의 근권 토양을 수집하였다. 기주식물의 뿌리가 상하지 않도록 조심하여 채집한 후 근권 토양을 1 kg 정도 함께 채취하여 밀폐 가능한 비닐백에 함께 옮겨 담아 실험실로 옮겨왔다. 실험실로 가져온 야외 토양은 121ºC에서 20분간 멸균한 모래와 1:1의 부피로 섞어 포트에 옮겨 담아 다양한 수지상균근균에 감염될 수 있는 식물로 알려진 수수(Sorghum bicolor) 종자를 파종한 후 약 3개월간 일정한 온도의 배양실에서 배양하였다. 물은 1일 1회 충분히 급수하였다. 3개월 후 기주식물과 수수가 충분히 자란 후 급수를 중지하고 4주간 자연 건조하였으며 건조가 끝난 후 4ºC의 저온실에 토양을 저장한 후 포자 추출에 이용하였다.
포자추출
수지상균근균 포자의 추출은 wet sieving and sucrose density gradient centrifugation 방법[2]을 이용하였으며 추출한 포자 중 포자의 크기, 색깔, 표면의 특징이 동일한 포자를 모아 순수배양에 이용하였다. 멸균한 모래를 깨끗한 포트에 옮겨 담고 무균 발아한 수수의 어린 식물을 옮겨 심었다. 이때 수수의 뿌리에 순수배양에 이용할 포자를 멸균수와 함께 마이크로 파이펫을 이용하여 부착시킨 후 옮겨 심고 3개월 간 일정한 온도 조건에서 배양하였다. 배양 기간 동안 물은 1일 1회 급수하고 1/20 농도의 인산을 포함하는 Hoagland solution을 1주일에 1회 200 mL 공급하였다[3]. 3개월 후 수수의 뿌리를 trypan blue로 염색하여 수지상균근균 감염 여부를 확인하고[4], 감염이 확인된 포트의 토양은 멸균한 모래와 섞어 다시 대량 배양에 이용하였다.
포자의 형태적 특징을 이용한 동정
대량배양에 성공한 종은 슬라이드 표본을 제작하여 각 종의 형태적 특징을 관찰하였다. 슬라이드 글라스에 포자를 두 그룹으로 나누어 모아놓고 한쪽에는PVLG(polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol)를, 그리고 다른 쪽에는 PVLG와 Melzer's reagent를 1:1로 섞은 고정액을 떨어뜨린 후 커버 글라스를 덮고 적당한 압력을 주어 포자를 깨뜨리고 슬라이드 표본을 제작하였다. 슬라이드 표본은 광학현미경(AXIO Imager. A1, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하면서 포자벽의 수와 구조, 포자벽 표면 장식(ornament) 및 부착 균사의 유무와 특징을 관찰하여 기재하였다[5-8].
rDNA염기서열을 이용한 계통분석
정확한 동정을 수행하기 위해 각 포자의 18S rDNA 염기서열을 분석하였다. 육안상 깨끗한 포자를 골라 0.2 mL의 PCR 튜브에 옮겨 담아 포자를 파쇄한 후 nested PCR을 수행하였다[9]. 1차 PCR은 universal 프라이머인 NS1/NS4를 이용하였고 1차 PCR 반응물을 1/10으로 희석하여 2차 PCR의 주형으로 사용하였다. 2차 PCR은 수지상균근균 특이 프라이머인 AML1/AML2를 이용하였고 2차 PCR 반응물을 1.5% agarose gel상의 전기 영동(100V, 25분)을 이용하여 약 780 bp의 PCR 반응물을 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent, Korea). 염기서열 정보는 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLAST(Basic Local Ali- gnment Search Tool)를 이용하여 일치도가 가장 높은 종을 확인하였다. 확인된 종들에 대한 염기서열을 NCBI로부터 내려 받아 MEGA 5를 이용하여 alignment한 후 유연관계 계통도를 작성하여 종을 동정하였다[10].
결과 및 논의
본 연구에서 4속 5종의 수지상균근균을 동정하였다: Acaulospora cavernata, Claroideoglomus luteum, Diversispora aurantium, D. trimurales, Rhizophagus irregularis 18S rDNA를 이용하여 계통분석을 수행하였으며(Fig. 1), 각 종의 포자의 형태적 특징은 아래와 같다.
Fig. 1. Neighbor-joining phylogenetic tree for partial 18S rDNA sequence of arbuscular mycorrhizal fungal spores in this study. Numbers at nodes indicate bootstrap support (1,000 replicates). Bold letters indicate the sequences from this study.
Acaulospora cavernata Blaszk.
연한 갈색-갈색 빛을 띠는 회색을 띠는 포자를 형성한다(Fig. 2). 이 종의 포자들은 해부현미경 하에서도 Acaulospora spinosa의 포자처럼 표면이 사포와 같은 거친 느낌을 준다. 포자벽에는 특이한 형태의 홈이 있는데(Fig. 2A), 이런 홈을 갖는 다른 Acaulospora 속 포자들에 비해 A. cavernta의 홈은 상대적으로 크기가 크다. A. cavernata는 3개의 벽으로 구성된 포자벽(SW)과 두 개의 발아벽(GW1, GW2)으로 구성되어 있다(Fig. 2B and 2C). 첫 번째 포자벽 L1은 시간이 지남에 따라 분해되어 사라지기도 한다. L2는 여러 층의 벽이 매우 가깝게 겹쳐 있는 laminate층인데, L2의 표면에 규칙적인 홈이 존재한다. GW1은 거의 하나로 붙어 있는 것처럼 보이는 2개의 층(L1, L2)으로 구성되며 GW2는 세 개의 층(L1, L2, L3)으로 구성되어 있다. GW2의 첫 번째 층(L1)은 표면이 고르지 못한 울퉁불퉁한 층이고 두 번째 층(L2)은 상대적으로 두꺼운 유리질 층이다. 가장 안쪽의 세 번째 층(L3)은 거친 표면을 가지며 Mel- zer's reagent에 검붉은색으로 반응하는 약간 단단한 벽이다(Fig. 2C). 관찰표본은 GB13123이며 경북 문수산의 팥배나무(Sorbus alnifolia) 근권에서 분리하였다.
Claroideoglomus luteum (Kenn., Stutz & Morton) Walker & Schüßler
포자의 색은 옅은 노란색이나 옅은 갈색 빛을 띤 노란색이다(Fig. 3). 포자의 형태는 거의 대부분이 구형이며 직경은 60~180 μ m이다. 포자벽은 4개의 벽(L1, L2, L3, L4; Fig. 3B)으로 구성되며 이 벽들은 모두 함께 붙어 있지만 포자에 압력을 주어 깨트리면 L4는 다른 벽들과 분리되기도 한다. 어린 포자에서는 주로 L1, L2층만 존재하다가 성숙하면서 점자 나머지 층들이 순서대로 형성되고, L1, L2층은 점차 사라지기도 한다. C. luteum의 포자벽들은 Melzer's reagent에 의한 염색 반응은 나타나지 않는다. L4는 발아벽처럼 보이기도 하지만 발아과정에서 역할을 하지는 않는 것으로 보인다. L1, L2, L3는 부착균사와도 연결되어 있지만 L4는 폐쇄적인 구조를 갖는 것으로 보인다. C. claroideum 및 Rhizophagus clarus와 포자의 형태가 유사하나 포자벽의 비교를 통해 이들을 구분할 수 있다. 관찰표본은 CN14012이며, 충남 원산도에서 서식하는 광릉개밀(Agropyron yezoense) 근권에서 분리하였다.
Diversispora aurantium (B
aszk., Blanke, Renker & Buscot) Walker & Schüßler
어린 포자는 흰 빛에 가까운 노란색이지만 성숙한 포자는 진한 오렌지 색이나 금빛을 띠는 노란색이다(Fig. 4). 포자벽은 3개의 벽(L1, L2, L3; Fig 4C)으로 구성된다. 가장 바깥의 L1은 유연하고 부드러워 PVLG 상에서 부풀어 오르기도 한다. L1에는 토양 내 유기물들이 붙어 있어 지저분해 보이기도 한다. L2는 흰 빛이나 금 빛을 띠는 노란색이며 L3와 밀착되어 있어 잘 떨어지지 않는다. D. aurantium의 포자벽들은 Melzer's reagent에서 반응하지는 않는다. 부착균사는 원통형 혹은 부풀어 오른 모양으로 곧거나 뒤로 휘어가며 뻗어나간다. 부착균사의 벽은 기저부에서 포자의 3개의 벽과 이어져 있다. 관찰균주는 CN14129이며, 충남 대난지도에 서식하는 초피나무(Zanthoxylum bungeanum)의 근권에서 분리하였다.
Diversispora trimurales (Koske & Halvorson) Walker & Schüßler
포자는 토양 내에서 독립적으로 형성되며 옅은 노란색이나 옅은 황갈색을 띠고 포자의 형태는 거의 구형이나 타원형에 가깝다(Fig. 5). 포자벽은 3개(L1, L2, L3; Fig 5C)로 구성된다. 가장 바깥쪽 벽인 L1 은 여러 겹의 층으로 구성된 laminate 벽으로 연한 노란색-노란 빛을 띠는 갈색을 띤다. L3 역시 매우 얇은 층들로 이루어져 있으나 경계가 희미하거나 불분명한 경우가 있어 하나의 층으로 보이기도 한다. 부착균사는 대개 곧게 뻗거나 부착지점에서 약간 수축되어 있으며 옅은 노란색을 띤다. 부착균사의 벽과 포자벽의 세 개의 벽은 서로 이어져 있다. 관찰균주는 CN14006이며, 충남 대천에 서식하는 쥐똥나무(Ligustrum obtusifolium)의 근권에서 분리하였다.
Rhizophagus irregularis (B
aszk., Wubet, Renker & Buscot) Walker & Schüßler
포자의 색은 투명하거나 연한 갈색을 띤다(Fig. 6). 포자는 독립적으로 혹은 cluster로 함께 발생하기도 하지만 식물의 뿌리 내부에서도 발생한다. 포자의 형태는 대부분 구형이나 일부는 타원형이나 불규칙하게 울퉁불퉁한 형태를 갖기도 한다. 포자벽은 세 개의 벽(L1, L2, L3; Fig. 6Band 6C)으로 이루어진다. 가장 바깥쪽의 L1은 포자가 성숙하면 사라지며 Melzer's reagent에서 반응하지 않는다. L2와 L3는 포자가 성숙하면서 순차적으로 형성되는데, L3는 Melzer's reagent에서 진한 붉은색-검붉은색으로 염색된다(Fig. 6D). 부착균사는 대개 원통형이나 나팔형(flared)이며 3개의 포자벽이 부착균사까지 이어져 있다. 부착균사의 L3가 Melzer's reagnet에서 반응하여 진한 붉은색-검붉은색으로 염색된다. R. intradices와 형태적으로 매우 유사하여 비교적 최근 새롭게 동정되었다[11]. 포자벽의 구조는 유사하지만 R. intraradices의 L1이 Melzer's reagent에 반응하여 붉은색으로 염색되는데 비해 R. irregularis는 L3가 염색되기 때문에 서로 구분 가능하다. 관찰균주는 CN14040이며, 충남 삽시도에 서식하는 쥐똥나무(Ligustrum obtusifolium)의 근권에서 분리하였다.
Fig. 6. Rhizophagus irregularis (CN14040). A, spore and subtending hyphae; B, C, spore structure in PVLG; D, spores and subtending hypae in Melzer's reagent. L1~L3 indicates each layers of the spore wall.
수지상균근균의 생물자원으로서의 높은 중요성에도 불구하고 인공배양의 어려움 때문에 수지상균근균의 연구에 많은 제한점을 갖고 있다. 하지만 지속적으로 수지상균근균을 수집하고 배양하는 것은 국내 생물자원의 확보뿐만 아니라 친환경 농업기술의 개발이나 훼손된 지역의 생태적 복원기술개발을 위해서도 반드시 필요한 과정이다. 현재까지 국내에는 전 세계적으로 기록된 수지상균근균 가운데 일부만이 보고되었으며, 단일 종 배양은 거의 없는 실정이다. 따라서 유용한 생물자원으로서의 수지상균근균 이용 가치를 높이고 국내 산림 생태계에서의 수지상균근균의 다양성과 기능을 이해하기 위해 수지상균근균의 수집·분류와 배양기술의 개발이 시급하다고 생각된다. 최근의 생물다양성에 대한 높은 관심은 미개척 생물군에 이르기까지 확장되고 있는 실정이다. 따라서 이와 같은 순수배양을 통한 균주의 수집은 생물자원 확보 및 생물주권에 기여할 수 있으며, 응용 분야에도 긍정적인 파급효과를 생산할 수 있기 때문에 지속적인 관심과 연구가 필요하다.
