체리(Prunus avium L.)는 장미과 벚나무속 식물의 열매로 양앵두, 단체리, 단벚나무, 단버찌 등 다양한 이름으로 사용되고 있다. 국내에는 1920년대 일본인에 의해 경주 지역에서 처음으로 과원이 조성되어 재배되기 시작했으며, 최근 재배면적이 꾸준히 증가하여 2013년에는 120 ha에 이르렀고, 총생산량은 586톤이었다[1,2]. 2013년 8월, 경기도 화성시에 위치한 과수원에서 체리 과실에 회색의 포자 덩어리가 밀생하여 상품가치가 떨어지는 잿빛무늬병 증상이 관찰되었다. 병든 과실에서 병원균을 순수분리하여 균학적 특성 및 DNA 염기서열을 조사한 결과 Monilinia fructicola로 동정되었으며, 체리 과실에 인공접종하여 병원성을 확인하였다.
국내에서 체리에 발생하는 진균병으로는 Monilinia laxa에 의한 잿빛무늬병을 비롯하여 Botryosphaeria dothidea에 의한 줄기썩음병, Botrytis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병 등 8가지의 병이 보고되어 있다[3]. Monilinia균은 체리, 복숭아, 자두, 사과, 배 등 여러 가지 과수류에 잿빛무늬병을 일으키는 병원균으로, 전세계적으로 M. fructicola, M. fructigena, M. laxa등 3종이 주요 병원균으로 알려져 있다[4]. 국내의 경우, M. fructicola는 매실, 복숭아, 자두, 살구 등에서 보고되었고, M. fructigena는 사과와 배, M. laxa는 체리에서 보고되었다[3].
본 연구에서는 체리 과실에 발생하는 잿빛무늬병의 병징과 병원균의 균학적 특성, 염기서열 분석 결과 및 병원성 검정에 대한 결과를 보고하고자 한다.
병징
과실에 갈색의 수침상 원형 병반이 나타나고, 진전되면 과실전체가 부패한다. 부패된 과실에 회갈색이나 연갈색의 포자덩어리가 관찰된다(Fig. 1A). 감염된 과실은 결국 쪼글쪼글해지고, 검게 말라 땅에 떨어지거나 가지에 남아있게 된다(Fig. 1B). 특히 과실에 발생된 M. fructicola에 의한 병징은 M. laxa에 의한 병징과 매우 유사하나, M. fructicola에 감염될 경우 어린 과실에서는 병징이 나타나지 않다가 과실이 성숙되면 균사가 관찰되는 것으로 알려져 있다[5].
Fig. 1. Symptoms and mycological characteristics of brown rot of cherry fruits caused by Monilinia fructicola, A and B indicated brown rotted fruits covered with the grayish spore mass and dark black mummified fruits, respectively. C and D indicated top and bottom view of M. fructicola cultured on PDA after 7 days. E, lemon shaped conidia of M. fructicola are produced in beads like strings; F, asymmetric phialides and microconidia on old colony, scale bars = 10 μm. G and H indicated symptoms on wounded cherry fruit artificially inoculated with M. fructicola and control, respectively.
균학적 특성 및 염기서열 분석
병원균을 분리하기 위하여 병든 조직과 건전한 조직의 경계부위를 5 × 5 mm 크기로 잘라 1% NaOCl 용액에 표면살균하고 멸균수로 세척한 후 화염소독한 여과지를 이용하여 물기를 제거하고 물한천배지(water agar)에 치상하였다. 치상 5~7일 후, 자라난 균총으로부터 Monilinia균을 단포자 분리하여 사면 감자한천배지(PDA)에 옮겨 배양하고, 이 균주를 10ºC에 보관하면서 실험에 사용하였다. 분리한 Monilinia균의 균학적 특성은 PDA배지, 25ºC의 NUV/암조건(12시간/12시간)하에서 7일간 배양한 후 조사하였다.
PDA에서 균총은 3일간 56~70 mm 생장하였고, 기중균사는 흰색 내지 회색에서 갈색을 나타내었다. 또한 PDA상에서 균총의 모양은 가장자리가 매끄러운 형태였으며, 포자를 풍부하게 형성하고, 포자형태는 염주상으로 사슬모양을 나타내었다(Fig. 1C-1F). 유럽, 미국 등에서는 핵과류에 잿빛무늬병을 일으키는 Monilinia균 가운데 병징으로 구분이 어려운 M. fructigena, M. fructicola, M. laxa의 동정을 위한 여러 연구가 수행되었다. 이들 균주에 대해 균사생장율을 조사한 연구에 의하면 M. laxa가 M. fuctigena와 M. fructicola보다 생육이 느린 것을 보고하였고, M. laxa의 균총 형태는 나머지 두 종과 달리 가장자리가 갈라져 있는 것이 대표적인 차이점으로 알려져 있다[6]. 또한 발아관의 길이 역시 M. laxa의 경우 M. fructigena, M. fructicola에 비해 현저히 짧은 것으로 보고된 바 있다[7]. 이와 같은 균학적 특성을 고려하여 체리 병반에서 분리한 2개의 Monilinia균을 M. fructicola로 동정하였다(Table 1).
Table 1. Comparison of morphological and cultural characteristics between the present isolates obtained from infected cherry fruits and Monilinia species described previously
M. fructicola로 동정된 균주의 ITS 영역의 염기서열 분석을 수행하였다. PDB 배지에 키운 균사를 동결건조한 후 마쇄하여 CTAB법으로 genomic DNA를 분리하였다[8]. rDNA ITS 영역의 염기서열 분석을 위하여 프라이머 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하여 PCR 증폭하였다[9]. 증폭된 PCR산물은 Wizard SV Gel & PCR Clean-up System kit(Promega)를 사용하여 정제한 후, pGEM-T easy vector와 ligation하고, heat shock방법으로 형질전환시켜 blue-white screening법으로 형질전환체를 선발하였다. 선발된 형질전환체로부터 Wizard Plus SV Minipreps(Promega)를 이용하여 plasmid를 추출하였고, ABI 3730 DNA analyzer(Applied Biosystems)로 염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열은 Clustal W 소프트웨어를 이용하여 정렬하였고, nucleotide의 유사도를 계산하였다. 계통수는 MEGA 4.0 프로그램을 이용하여 neigh- bor-joining법에 의해 작성하였다. 균학적 특성 조사에서 M. fructicola로 동정되었던 균주는 ITS 염기서열 분석에 의하여 스페인의 핵과류에서 분리한 M. fructicola(NCBI accession number EF207423, FJ515894)와 상동성이 100%로 나타났다(Fig. 2). 분리된 NC13-098, NC13-100 균주는 각각 KM279616과 KM279617의 accession number로 Gen- Bank에 등록하였다.
병원성 검정
체리 과실에 대한 병원성을 확인하기 위하여 외관상 건전한 체리 과실을 70% 에탄올로 상처가 생기지 않도록 닦은 후, 1% NaOCl 용액에 10분간 침지하여 부생균을 제거하고, 멸균수로 3회 세척하여 무균대에서 건조시켰다. 분리한 병원균 M. fructicola NC13-098과 NC13-100 균주는 PDA배지에서 7일간 배양한 후, 멸균수로 포자를 회수하여 1 × 105 spores/mL의 농도로 포자현탁액을 만들었다. 멸균한 바늘로 체리 과실을 찔러 상처를 낸 과실과 상처가 없는 과실에 포자현탁액 10 μ L를 떨어뜨려 접종하였고, 대조구는 상처 및 무상처 과실에 멸균수로 처리하였다. 각각의 과실을 습실처리한 플라스틱 박스에 넣고 25ºC의 배양기에 두면서 습도와 온도를 유지시켰다. 접종 7일 후, 상처의 유무에 관계없이 병원균을 접종한 부위에서 수침상의 둥근 병반이 관찰되었고, 특히 상처구에서는 균사가 형성된 것을 확인할 수 있었으며, 대조구에서는 병징이 나타나지 않았다(Fig. 1G, 1H, Table 2). M. fructicola에 의한 잿빛무늬병은 세계적으로 핵과류에 발생하는 중요한 병으로 알려져 있으며, 미국 캘리포니아 지역에서는 이 균의 살균제 저항성을 보고한 바 있다[10]. 우리나라에는 체리 잿빛무늬병균으로 M. laxa만이 보고되어 있으나 미국에서는 이 병에 주로 M. fructicola가 관여하며, M. laxa도 병을 일으킨다고 보고된 바 있다[11]. 따라서 국내에서도 체리를 재배하는 다양한 지역에서 잿빛무늬병균을 분리하여 M. fructicola와 M. laxa의 분포비율을 조사할 필요가 있을 것으로 생각된다.
이상과 같이 체리 과실에 발생한 잿빛무늬증상에서 분리한 병원균은 균학적 특성과 DNA 염기서열 분석에 의해 M. fructicola로 동정되었으며, 이 균은 체리에 병원성이 있음이 확인되었다. 따라서 본 결과를 토대로 국내 체리 잿빛무늬병에는 현재 알려져 있는 M. laxa 이외에 Monilinia fructicola (G. Winter) Honey가 관여하는 것을 처음으로 보고한다.
