New Records of Fungi Isolated from Indoor Air of Greenhouse Used for Shiitake Cultivation in Korea

표고[Lentinula edodes (Berk.) Pegler, 1975]는 담자균문주름버섯목 낙엽버섯과의 버섯으로 맛과 풍미가 뛰어나며 항암과 항비만 효과를 가지고 있는 고가의 식용버섯이다[1, 2]. 1950년대에 제주도 한라산에서 시작된 국내의 표고재배는 재배 기술의 발달과 더불어 안정된 생산 기반이 구축되었고 더불어 재배 농가 수도 꾸준히 증가하고 있다. 표고를 재배하기 위해서 원목을 이용하는 방식과 톱밥 배지를 이용하는 방식이 사용된다. 원목을 이용하는 전통적인 방식은 고품질의 표고를 생산할 수 있지만 많은 노동력이 필요하며, 원목에 표고종균 접종 후 그 다음해에 자실체를 수확하기 때문에 자금 회전율이 늦다는 단점이 있다. 반면에 톱밥 배지를 사용하는 재배 방식은 원목 재배 방식에 비해서 재배 환경의 관리가 비교적 쉽고 노동력이 덜 필요하며 자금 회전율이 상대적으로 빠르다는 장점이 있다. 이런 이유로 원목 재배와 더불어 최근 톱밥 배지를 이용한 재배 방식의 선호도가 높아져 가고 있다.

원목 재배와 톱밥 재배 모두 균류에 의해 심각한 피해를 받을 수 있다. 표고 재배에 피해를 주는 주요 진균으로는 Aspergillus, Penicillium, Trichoderma 속 등에 속하는 종들이 보고되었다[3-5]. 이들 진균은 포자를 많이 형성하며 기류에 따라 쉽게 부유하여 공기 중으로 비산하기 때문에 위생적으로 볼 때 표고 재배사 내의 실내공기질 관리가 필요하다. 이에 따라 진균의 오염을 예방하기 위해서 재배사내 공기에 부유하는 진균 포자에 대하여 지속적인 모니터링이 요구되고 있다. 본 논문에서는 표고 재배사의 공기에 존재하는 진균을 모니터링 하는 과정에서 분리 동정한 진균 종 중에서 국내 미기록 종 2종과 더불어 국내에 이름은 알려져 있으나 균학적으로 확증되어 있지 않은 2종에 대하여 균학적 정보를 보고하고자 한다.

부유진균은 2013년 3월부터 2013년 7월까지 충청남도 청양과 전라남도 장흥에 위치한 표고 재배사 내의 실내 공기로부터 채집하였다. 공기 채취는 ISO 16000-18에 기반한 충돌법에 따라 Andersen sampler (Single Stage Am- bient Viable Sampler, Model 10-880; Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 28.3 L/min 유량으로 1분간 채집하였다[6]. 공기 채집은 표고 재배사의 가운데 지점에서 진행하였고 높이는 1.3 m 높이에서 수평을 맞추어 수행하였다(Fig. 1). 배양 배지로서는 암피실린(ampicillin)을 100 g/mL 농도로 첨가한 MEA (malt-extract agar, Difco, BD science, France)를 사용하였다.

Fig. 1. An example of indoor air sampling using Andersensamplers in a greenhouse for shiitake cultivation (A). An example of fungal colony formed on malt extract agar (MEA) after grown at 25^oC for 3 days (B).

실내 공기를 채집한 배지를 3~5일 동안 25^oC 배양기에서 배양하였고, 자라난 진균은 단포자 분리를 통해 순수분리를 하였다. 순수분리된 진균의 미세구조는 광학현미경(Axioskop40, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 분리된 균들의 형태학적 특징은 Table 1에 정리하였다. 또한 분자적 특징을 알아보기 위해 drilling 방법에 따라 genomic DNA를 추출하고[7], internal transcribed spacer 1 (ITS1) (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3')/ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[8]과 BT12 (5'-GT TGTCAATGCAGAAGGTCTC-3')/T10 (5'-ACGATAGGT TCACCTCCAGAC-3')[9, 10] 프라이머를 이용하여 ITS region과 β-tubulin gene sequence를 polymerase chain reaction (PCR) 증폭하였다. PCR 증폭은 ITS region과 β-tubulin gene 모두 동일하게 진행하였다. 94^oC에서 5분간 predenaturation 한 후, denaturation 94^oC 30초, annealing 56^oC 30초, elongation 72^oC 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72^oC에서 10분간 final extension하여 수행하였다. PCR 증폭된 DNA 산물은 1% (w/v) 아가로스겔 전기영동을 수행하여 확인한 후 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Basel, Swiss)를 사용하여 정제하고 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석균주와 관련된 taxon의 염기서열은 NCBI의 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에서 다운받아 사용하였고 MEGA 5 프로그램[11]을 이용하여 염기서열의 유사도 및 phylogenetic analysis를 수행하였다. 계통도는 neighbor-joining 방법[12]으로 분석하였고 계통도 가지의 clade 신뢰도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가하였다.

Table 1. Morphological characters of the fungal isolates characterized in this study

사용된 비교 균주 염기서열에는 Aspergillus pulverulentus 표준균주(CBS 558.65)의 β-tubulin sequence, Lecanicillium antillanum 표준균주(CBS 350.85)와 L. psalliotae 표준균주(CBS 532.81)의 ITS sequence를 포함하여 분석하였다. Cosmospora butyri 표준균주(CBS 301.38)는 ITS sequence가 GenBank에 등록되지 않아서 등록된 ATCC 52620 균주의 ITS sequence를 사용하여 분석하였다. 동정된 DK8-5, DK8-6, DK8-7, DK8-12 균주는 국립생물자원관에 기탁하여NIBRFGC000130016, NIBRFGC000130017, NIBRFGC000130018, NIBRFGC000130022 등으로 각각 기탁번호를 받았다.

균주 DK8-6(Aspergillus pulverulentus)

충남 청양의 표고 재배사 내 공기에서 분리되었다. Potato dextrose agar (PDA) 배지에 25^oC에서 7일 동안 배양한 결과 균총의 직경은 약 72 mm 정도이었고 균사의 밀도는 조밀하였다(Fig. 2A). 균총 표면의 색상은 검은색으로 표면에 삼출물은 보이지 않았다. 배지 뒷면의 중앙은 옅은 노란색이며 가장자리로 갈수록 엷은 미색을 나타내었다. Conidiophore는 980 ± 200 × 2.3 ± 0.3 m 크기로서 상단 끝에 conidiophore head를 형성하였다(Fig. 2A-1, 2A-2, Table 1). Conidia는 어두운 갈색의 2.3 ± 0.1 × 2.3 ± 0.1 m 크기의 둥근 모양이었다. 이는 기존에 보고된 A. pulverulentus(McAlpine) Wehmer 균의 특징과 유사하였다[13]. DK8-6 균주는 최근에 보고된 Aspergillus Nigri 섹션에 속하는 종[14]들과 더불어 비교시 A. pulverulentus 표준균주인 CBS558.65의 β-tubulin gene sequence (HE984408)과 99%의 유사도를 보였고 A. tubingensis (AY820007)과는 97% 유사도를 보였다. 반면에 A. pulverulentus 표준균주(HE984408)은A. tubingensis (AY820007)과 98% 유사도를 나타내었다. 이러한 유사도에 맞게 phylogenetic analysis 결과 계통수에서 DK8-6는 A. pulverulentus, A. tubingensis와 같은 위치에 존재하였다(Fig. 3). A. pulverulentus는 땅콩 작물에 crown rot 또는 collor rot을 일으키는 식물병원균으로 국내 미기록 종이다[15]. 산업적으로는 β-xylosidase를 생산하여, xylooligosaccharides로부터 hydroquinone β-xyloside를 합성하는데 사용된 보고가 있다[16]

Fig. 2. Colony morphology on malt-extract agar (MEA) plate and optical microscopic images of conidia and mycelia of the four fungal species isolated from indoor air of greenhouses for shiitake cultivation. (A) DK10-6, (B)DK10-7, (C) DK10-12, (D) DK10-5. (scale bars: A-2, B-2, C-2, D-2 = 3 μm), (scale bars: A-3, B-3, C-3, D-3 = 10 μm).

균주 DK8-7(Cosmospora butyri)

전남 장흥의 표고 재배사 내 실내공기에서 분리되었다. PDA 배지에 25^oC에서 7일 동안 배양한 결과 균총의 직경은 약 80 mm 정도이며, 균사의 조밀도가 높지 않았다. 균총 표면의 색상은 하얀색이며 단단하였다. 뒷면은 하얗거나 반투명하였다(Fig. 2B). 분생포자와 분생포자경을 관찰한 결과, conidiophore는 unbranched하고 conidia는 투명하며 8.2 ± 0.3 × 4.2 ± 0.2 μm 크기의 타원형이었고 1개의 격벽을 가지고 있었다(Fig. 2B-2, 2B-3, Table 1). 이 균주는 C. butyri (ATCC 52620) 균주의 ITS sequence와 99%의 유사도를 보였고 phylogenetic analysis 결과 계통수에서도 C. butyri와 같은 위치에 존재하였다(Fig. 4). 국내 미기록 종인 C. butyri는 이전에 Tilachlidium butyri J.F.H. Beyma로 보고되었다가 Acremonium butyri (J.F.H. Beyma) W. Gams로 재분류되었는데 최근 2011년에 Cosmospora butyri (J.F.H. Beyma) Grfenhan, Seifert & Schroers로 다시 분류된 균이다[17]. C. butyri는 2차 대사물질로 orbuticin을 생산하며 Phytophthora infestans, Pyricularia oryzae와 Erysiphe graminis p.v. hordei 같은 식물병원성 진균을 약하게 억제한다는 보고도 있다[18]. 이에 따라 향후 DK8-7균주가 표고 재배에 있어서 표고 균사의 생육을 억제하는지 검토가 필요할 것으로 생각한다.

균주 DK8-12(Lecanicillium psalliotae)

충남 청양의 표고 재배사 내 실내공기에서 분리되었다. PDA 배지에 25^oC에서 7일 동안 배양한 결과 균총의 직경은 약 55mm 정도였고 균사의 밀도는 조밀하지 않았다(Fig. 2C). 균총 표면의 색상은 아이보리색이고, 뒷면은 반투명하였다. Conidiophore는 aculeate로서 다소 긴 형태였고 conidia는 7.5 ± 0.2 × 3.7 ± 0.1 μm 크기의 타원형이며 투명하였다(Fig. 2C-2, 2C-3, Table 1). 이 균주는 Lecanicillium psalliotae 표준균주(CBS 532.81)의 ITS 염기서열(JN049846)과 99%의 유사도를 나타내었고 phylogenetic analysis 결과에서도 L. psalliotae와 함께 계통도상에 위치하였다(Fig. 5). L. psalliotae는 이전에 Verticillium psalliotae Treschew로 분류되었다가 Zare 등[19]에 의해 2001년 L. psalliotae로 재분류되었다. L. psalliotae가 생산하는 chitinase 및 serine protease는 뿌리혹 선충인 root-knot nematode Meloidogyne incognita에 살선충 효과가 있어 biocontrol 균으로 가능성이 보고되어 있다[20, 21]. 국내에서도 선충 방제 관련하여 L. psalliotae가 분리되었다는 보고[22]가 있으나 형태적 특성이나 유전자 분석 등 분류학적으로 균학적 특성을 확증하지 않았고 더불어 알려진 균주 수집 센터에 균주가 기탁되지 않았다. 따라서 본 연구에서 균학적으로 동정된 DK8-12 균주가 한국의 L. psalliotae 대표 균주로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Fig. 3. Phylogenetic analysis for DK8-6 and related species inferred by the neighbor-joining method based on the β-tubulin gene sequences. Bootstrap values based on 1,000 replications are shown above the node. Scale bar, 0.02 nucleotide substitution per site. T means the type strain.

Fig. 4. Phylogenetic analysis for DK8-7 and related species inferred by the neighbor-joining method based on the internal transcribed spacer rDNA sequences. Bootstrap values based on 1,000 replications are shown above the node. Scale bar, 0.02 nucleotide substitution per site. T means the type strain.

Fig. 5. Phylogenetic analysis for DK8-5, DK-812 and related species inferred by the neighbor-joining method based on the internal transcribed spacer rDNA sequences. Bootstrap values based on 1,000 replications are shown above the node. Scale bar, 0.02 nucleotide substitution per site. T means the type strain.

균주 DK8-5(Lecanicillium antillanum)

충남 청양의 표고 재배사 내 실내공기에서 분리되었다. PDA 배지에 25^oC에서 7일 동안 배양한 결과 균총의 직경은 약 65 mm 정도이었고 균사의 밀도는 조밀하였다(Fig. 2D). 균총 표면은 부드럽고, 앞면과 뒷면 모두 흰색이었다. Conidiophore는 흰색이며 윤생형으로 가지 형태로 분지되어 있고, 타원형의 conidia를 많이 형성하였다(Fig. 2D-2, 2D-3, Table 1). Conidia 크기는 4.6 ± 0.1 × 1.3 ± 0.1 m였다. 이 균주는 L. antillanum 표준균주(CBS 350.85)의 ITS 염기서열(NR111097)과 99%의 유사도를 나타내었고 phylogenetic analysis 결과에서도 계통도상에 L. antillanum과 함께 위치하였다(Fig. 5). L. antillanum는 이전에 Verticillium antillanum R.F. Castañeda & G.R.W. Arnold로 분류되었다가 Zare 등[19]에 의해 2001년 L. antillanum (R.F. Castañeda & G.R.W. Arnold) Zare & W. Gams로 재분류되었다. 국내에서의 분리 보고는 Nguyen 등[23]에 의해 선충의 알을 분해하는 chitinase에 대한 연구 보고가 있다. 그러나 이 보고에서 형태적 특성에 대한 서술은 없었으며 ITS 유전자 염기서열을 분석하였다고 재료 및 방법에서는 서술하고 있으나 본문에서는 18S rDNA에 의거한 계통수로 보고하고 있어서 오류가 존재하였다. 또한 GenBank 탐색을 통해 94%의 유사도를 보인다고 하였다. 이에 반하여 본 연구에서 동정된 DK8-5 균주는 L. antillanum 표준균주와 99%의 유사도를 보이고 있다. 본 연구에서 형태적 특성의 기술과 더불어 국립생물자원관에 기탁된 바 DK8-5 균주 역시 한국의 L. antillanum 대표 균주로 사용이 기대된다.