Unrecorded Fungal Species Isolated from Greenhouses Used for Shiitake Cultivation in Korea

공기시료 채집 및 순수분리

재배사내의 진균은 2014년 2월, 6월, 9월에 전라남도 장흥,진도와 충청남도 청양에 위치한 표고 농장들의 실내공기를포집한 후 분리하였다. 이들 공기 채집한 표고 농장 재배사는 버섯파리가 존재하는 공간이었다. 공기 채취는 ISO16000-18에 기반한 충돌법에 따라 Andersen sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880; Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 28.3 L/min유량으로 1분간 포집하였다[8]. 공기 채집은 표고버섯 재배사의 가운데 지점에서 진행하였고 높이는 1.3 m 높이에서 수평을 맞추어 수행하였다(Fig. 1). 배양배지로서는 암피실린(ampicillin)을 100 μg/mL 농도로 첨가한 malt-extract agar (Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하였다. 실내 공기를 채집한 배지를 5일 동안 25oC 배양기에서 배양하였고, 자라난 진균은 단포자 분리를 통해 순수 분리하였다.

버섯파리 채집 및 순수분리

버섯파리의 채집은 실내공기를 포집한 장소에서 수행하였으며 원목 주변에 존재하는 버섯파리를 트랩을 설치하여 채집하였다. 채집한 버섯파리를 실험실로 옮긴 후 5% 차아염소산나트륨 용액에 1분 간 표면살균 후 멸균한 증류수에 1분 간 세척하였다. 100% 에탄올에 1분 간 다시 표면 살균 후 멸균한 증류수에 1분 간 세척하여 멸균된 필터여지에 상치하고 생물안전 캐비넛에서 물기가 마를 정도까지 자연 건조하였다. 건조 후 버섯파리 시료를 암피실린을 100μg/mL 농도로 첨가한 potato dextrose agar (PDA, Difco)에 치상하였다[9]. 치상한 배지를 2일간 25oC 조건 배양기에 배양 후 자라나온 균사를 새 배지로 옮겨가며 순수 분리하였다.

형태학적 및 분자생물학적 동정

순수 분리된 진균의 미세구조는 광학현미경(Axioskop40; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)과 주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope/Energy Dispersive X-ray Spectrometer, S-4300; HITACHI, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 또한 분자적 특징을 알아보기 위해 drilling 방법에 따라 genomic DNA를 추출하고[10], ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCG-3') / ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [11]과 cmd5 (5’-CCGAGTACAAGGAGGCCTTC-3’) / cmd6 (5'-CCGATAGAGGTCATAACGTGG-3') [12] 프라이머를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) rDNA region과 calmodulin gene sequence를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)증폭하였다. ITS region은 94oC에서 5분간 predenaturation한후, denaturation 94oC 30초, annealing 56oC 30초,elongation 72^oC 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72^oC에서 10분간 final extension하여 수행하였다.Calmodulin gene은 94oC에서 5분간 predenaturation한 후,denaturation 94oC 30초, annealing 52oC 30초, elongation 72^oC 30초 조건에서 총 30 cycle 진행하고 마지막으로 72^oC에서 10분간 final extension하여 수행하였다. PCR 증폭된DNA 산물은 1% 아가로스겔에서 전기영동을 수행하여 확인한 후 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche,Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 정제하고 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.

분석된 염기서열은 분자동정을 위해 우선 진균의 바코드로 사용되는 ITS region 염기서열을 미국 National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 웹에 있는 BLAST 프로그램을 사용하여 DNA 데이터베이스에 등록되어 있는 진균들의 ITS와 상동성을 비교하였다. Penicillium 균의 경우는 ITS 염기서열에 더하여 추가로 calmodulin 유전자 염기서열의 상동성을 비교하였다.계통분석을 위해서는 분리 균주와 관련된 taxon 염기서열을NCBI의 GenBank에서 다운받아 MEGA 6 프로그램[13]을 이용하여 염기서열의 유사도 및 phylogenetic analysis를 수행하였다. 계통도는 neighbor-joining 방법[14]으로 분석하였고 계통도 가지의 clade 신뢰도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가하였다.

Fig. 1. An example of indoor air sampling using an Andersen-sampler in a Greenhouse used for shiitake cultivation (A). An example of fungal colony formed on malt-extract agar after grown at 25oC for 5 days (B). Morphology of a mushroom fly collected in the greenhouse (C).

형태적 특징 관찰

공기와 버섯파리로부터 분리된 진균은 배지의 균총을 형태적으로 구분하였을 때 8개 그룹으로 나누어졌다. 이에 따라 이들 그룹의 대표적 균주인 DK9-1, DK9-2, DK9-5, DK9-6, DK9-9, DK9-10, DK9-11, DK9-12 등을 대상으로 비교 분석하였다. PDA에 7일간 배양 후 균총의 형태를 관찰 하였을 때, DK9-1 균주는 중앙에 노란색 환을 가지며 아이보리의 균사로 균일하게 자라나는 모양을 나타냈고(Fig.1A-1), DK9-2 균주는 생장이 매우 빠르며 균사의 색은 회색으로 솜 구조처럼 부푼 모양으로 자랐다(Fig. 1B-1). DK9-5 균주는 생장이 느리며 균총의 색이 흰색이고 중앙에 돔모양으로 성장하였다(Fig. 1C-1). DK9-6 균주는 균사의 색은 회색에서 흰색으로 자라며 중앙에 녹회색의 환을 생성하며 자랐다(Fig. 1D-1). DK9-9 균주는 중앙의 갈색 균사로부터 점점 아이보리색을 띄며 균사가 생장하였다(Fig.1E-1). DK9-10 균주는 생장이 느리며 균총의 색이 노란색이고 방사형으로 생장하였다(Fig. 1F-1). DK9-11 균주는 생장이 느리며 균사의 색이 아이보리색을 띄며 불규칙하게 자랐다(Fig. 1G-1). DK9-12 균주는 생장이 느리며 중앙의 녹회색균사에서 짙은 녹색의 균사로 생장하였다(Fig. 1H-1).광학현미경과 주사전자현미경으로 관찰하였을 때 DK9-1균주는 3.6 ± 0.1 × 2.5 ± 0.2 μm 크기의 타원형 형태의 경자가 분생자경에서 7~8개가 분지하였고, 4~5개 타원형의 1.6± 0.2 × 1.3 ± 0.2 μm 크기의 분생포자가 연속적으로 경자에 존재하는 전형적인 Penicillium속 구조를 가지고 있었다(Fig. 1A-2). DK9-12 균주는 DK9-1 균주와 유사한 3.6 ±0.1 × 2.5 ± 0.2 μm 크기의 타원형 형태의 경자가 분생자경에서 5~6개가 분지하였고, 구형의 1.3 ± 0.1 × 1.3 ± 0.3 μm 크기의 분생포자가 경자에 존재하는 전형적인 Penicillium속 구조를 가지고 있었다(Fig. 1H-2). DK9-2 균주는 구형 의 4.9 ± 0.1 × 4.8 ± 0.1 μm 크기의 분생포자를 가지고 있었다(Fig. 1B-2). DK9-5 균주, DK9-6 균주와 DK9-9 균주는 균사의 조밀도가 높게 형성되어 있었다(Fig. 1C-2, D-2,E-2). DK9-10 균주는 균사에 4.3 ± 0.2 × 2.5 ± 0.1 μm 크기의 곤봉모양의 포자를 가지고 있었다(Fig. 1F-2). DK9-11 균주는 전형적인 효모의 형태를 나타냈으며 출아된 포자는 타원형의 2.3 ± 0.2 × 1.6 ± 0.1 μm 크기를 가지고 있었다(Fig. 1G-2). 조사된 균주 중 포자를 형성하는 균주들에 대한 포자의 형태적 특징의 비교 결과는 Table 1에 제시하였다. 동정한 균주와 기 보고된 균주를 비교한 결과 형태적 특성은 유사하였다.

Fig. 2. Colony morphology on potato dextrose agar plate and scanning microscopic images of conidia and mycelia of the seven fungal species isolated from indoor air of greenhouses (A-F, H) and a species isolated from mushroom flies (G). A-1, A-2, DK9-1; B-1, B-2, DK9-2; C-1, C-2, DK9-5; D-1, D-2, DK9-6; E-1, E-2, DK9-9; F-1, F-2, DK9-10; G-1, G-2, DK9-11; H-1, H-2, DK9-12 (scale bars = 10 μm).

분자생물학적 동정 및 계통분석학적 동정

본분리한 균주를 ITS 염기서열에 기반하여 분자생물학적 방법으로 동정한 결과 DK9-2 균주는 Mucor nidicola와 99%, DK9-5 균주는 Perenniporia medulla-panis와 100%,DK9-6 균주는 Ascochyta hordei와 100%, DK9-9 균주는 Cochliobolus kusanoi와 99%, DK9-10 균주는 Discosia artocreas와 100%, DK9-11 균주는 Pseudozama prolifica와 100%의 상동성을 보였다(Table 2). 그리고 Penicillium속의 형태적 특징을 보유한 균주 DK9-1과 DK9-12는 calmodulin 유전자 염기서열을 기반하여 동정한 결과 DK9-1 균주 는 Penicillium charlesii, 그리고 DK9-12 균주는 Penicillium brevicompactum와 100% 상동성을 보였다. 계통학적으로 분석한 결과 분리된 균주들은 각각의 균주들이 동정된 종들과 같은 그룹를 형성하였다. 그리하여 형태적(Table 1,Fig. 2), 분자생물학적 분석 결과(Table 2, Fig. 3)를 바탕으로 DK9-1는 P.charlesii, DK9-2는 M. nidicola, DK9-5는 P.medulla-panis, DK9-6는 A. hordei, DK9-9는 C. kusanoi,DK9-10는 D. artocreas, DK9-11는 P. prolifica, DK9-12는 P. brevicompactum로 각각 동정하였다(Fig. 2). 이중 M.nidicola, P. medulla-panis, A. hordei, D. artocreas, P. prolifica는국내 미기록 종이었다. 동정된 균주의 생체시료는 국립생물자원관에 기탁하여 DK9-1는 NIBRFGC000138367,DK9-2는 NIBRFGC000138368, DK9-5는 NIBRFGC000- 138370, DK9-6는 NIBRFGC000138371, DK9-9는 NIBRFGC000138374,DK9-10는 NIBRFGC000138375, DK9-11는 NIBRFGC000138378, DK9-12는 NIBRFGC000138376으로 기탁번호를 각각 부여 받았다. 이들 균주의 분석된ITS 및 calmodulin gene 염기서열은 NCBI 의 GenBank DNA database에 등록하였고 등록번호는 Table 2에 제시하였다.

P. charlesii는 견과류인 피칸에 곰팡이가 핀 것을 분리 동정하여 보고된 균으로 곰팡이 독소인 citreoviridin을 생성하는 것으로 알려져 있다[15]. 이 독소는 동물뿐만 아니라 밀, 옥수수 같은 식물에도 독성을 나타낸다고 보고되었다.최근 P. citreonigrum에서도 이 독소가 생성된다고 보고되었다[16]. M. nidicola는 2012년 invasive paper wasp인 Polistes dominulus의 nest에서 신종으로 분리되었다. 미국에서 최근에 보고된 종으로 아직 다른 특성에 대하여 보고가 되어 있지 않지만, 37oC 자라는 특성과 35oC에서 sporulation한다고 보고되었다. 분류학적으로 논란이 있는 M.hiemalis complex의 대표적 종으로 제안되고 있다[17]. P.medulla-panis는 담자균류이며, 인도에서 Perenniporia종에 의하여 폐에 진균구(Fungal ball)가 형성 되었다고 보고되 었다[18]. Ascochyta sp.는 식물에 병을 일으키는 균으로 보고가 되어 있으며, 병아리콩(Chick pea)에서 아스코키타 마름병(Ascochyta blight)를 일으킨다고 알려졌다[19]. P. charlesii와P. brevicompactum은 1980년 국내 보고가 되어 있으나[20] 형태학적 분석만 보고되어 있고 논문에 보고된 형태사진만으로는 종 구분하기 매우 어려운 실정이다. 특히 Penicillium 균류 분석은 형태만으로는 종 분석의 신뢰도가 낮은 바 분자적 분석에 따른 병합적 비교가 요구되고 있어서 이전에 보고된 균에 대한 추가 분석이 필요하다. 그러나 국내에 보고된 균주가 존재하지 않는 바 본 연구에서 분리 동정된 DK9-1 균주와 DK9-12 균주를 각각 이들 종의 국내 대표 균주 자원으로 활용하는 것이 좋을 것으로 생각된다.

Table 1. Morphological comparison of conidia between the Korean isolates and reference species

Table 2. Molecular identification of the fungal isolates using ITS rDNA or calmodulin gene sequences

ITS, internal transcribed spacer.

Fig. 3. Phylogenic relationships of DK9-1 Penicillium charlesii (A), DK9-2 Mucor nidicola (B), DK9-5 Perenniporia medulla-panis voucher (C), DK9-6 Ascochyta hordei (D), DK9-9 Cochliobotus kusanoi (E), DK9-10 Discosia artocreas (F), DK9-11 Pseudozyma prolifica (G) and Penicillium brevicompactum (H) inferred by the neighbor joining analysis based on internal transcribed spacer rDNA (B-G) or calmodulin gene (A, H) sequence data. Bootstrap value was given above/below the node. The Korean isolates were in bold.