서론
형광성 Pseudomonas속을 포함하는 여러 세균이 다양한 버섯에 병을 일으켜 수량성을 저하시킨다[1, 2]. 이들 중 가장 큰 피해를 주는 병원은 세균갈색무늬병을 일으키는 Pseudomonas tolaasii이며, 세균갈색무늬병은 1915년 Tolaas에 의하여 처음으로 보고되었으며[3], 1919년 Paine에 의하여 P. tolaasii로 명명되었다[4]. P. tolaasii는 느타리, 양송이, 표고 등에 갈색무늬병을 일으키며[5-7], 분류학적으로 버섯에서 분리되는 여러 종의 형광성 Pseudomonas종과 매우 유사하여, 생리적인 특성 및 영양요구성에 의한 방법으로는 동정하기가 쉽지 않다[8, 9]. 그리고 병징에 있어서는 P. tolaasii에 의한 갈색무늬 증상은 P. gingeri에 의해 발생되는 옅은 갈색(yellow-brown)의 반점병인 ginger blotch disease와 유사한 특성을 갖는다[10, 11]. 양송이 재배에 있어 또다른 2종류의 세균이 병을 일으키고 있으며 이들 중 P. gingeri는 giner blotch을 일으키고[10], P. agarici는 양송이 갓의 표면에 갈색의 점무늬를 넓게 형성하여 상품성을 저하시키는 것으로 보고되어 있다[12]. 또한 P. agarici는 느타리에 yellow blotch을 일으키고[13], 양송이 갓과 대에 회색무늬병을 일으킨다. 이 병은 병 발생의 예측이 매우 어렵고, 병 발생 후에는 방제가 거의 불가능하며, 한번 발생하면 재배사 전체로 급격하게 전염되어 심한 경우에는 버섯을 전혀 수확하지 못하게 하는 특성이 있다[14].
최근에는 친환경농업에 대한 관심이 증가되면서 화학농약의 대안으로 식물병원균에 대한 길항미생물의 생물학적 방제에 의한 연구가 활발하게 진행되고 있다[15]. 길항균을 이용한 갈색무늬병의 방제를 오스트리아에서 Nair과 Fahy[16]가 처음으로 연구하였고, 프랑스[17]와 타이완[18]에서 시행한 연구를 이용해 한때 상업적으로 생물학적 제제로 이용하였다. P. fluorescens가 P. tolaasii에 대해 길항성을 가진다고 하였으나 병원균에 비해 80배의 많은 수가 있어야효과가 있으므로 실용성이 떨어진다고 보고하였다[19]. 또한 국내에서는 세균갈색무늬병이 분비하는 독소를 저해하는 독소저해균 및 길항미생물을 선발하여 생물학적 방제를 위한 연구를 수행하고 있다[20, 21]. 이와 같이 세균병 방제를 위하여 항생제를 이용한 화학적 방제와 길항미생물을 이용한 생물적 방제법이 계속하여 시도되고 있지만 아직 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있는 실정이다[22]. 또한 버섯은 화학 처리에 의한 방제는 안전성 문제로 사용이 어렵기 때문에 생물적 방제법에 의한 새로운 방법의 도입이 요구되고 있다.
따라서 본 연구에서는 양송이 세균성회색무늬병의 생물학적 방제를 위하여 길항미생물을 선발 및 동정하여 화학 농약 대체를 위한 친환경 방제법을 개발할 목적으로 수행하였다.
재료 및 방법
미생물 분리
유용한 미생물을 분리하기 위해 재배중인 느타리버섯 수확 후 배지와 양송이 배지를 농가별 3점씩 채취하여 실험에 사용하였다. 미생물의 분리는 R2A 배지에 단계별로 희석배양하여 50~60개의 colony를 형성한 plate로부터 독립적으로 분리하였다. 순수 분리한 미생물은 R2A 배지에서 2일동안 배양한 후 균체를 모아서 20% (v/v) 글리세롤 용액에 넣어 -70oC에 보존하면서 검정용 시료로 사용하였다.
길항미생물의 선발
순수 분리한 미생물로부터 세균성회색무늬병균(P. agarici) 에 대한 길항균을 선발하기 위하여 paper disk methods를 이용하여 실험하였다. 병원균을 R2A 배지[23]에 24시간 배양한 후 균체를 모아 100 μL 멸균수가 든 1.5 mL e-tube에 넣고 현탁(5 × 106)하여 100 μL를 취하여 페트리디쉬에 도말하였다. 길항미생물 선발은 순수 분리한 미생물을 R2A 배지[23]에 48시간 배양한 후 균체를 모아 50 μL 멸균수가든 e-tube에 넣고 현탁(5 × 107)하여 70 μL를 취하여 8 mm paper disk에 접종하여 생육저지환의 정도에 따라 각 균주에 대한 길항능력을 평가하였다.
DNA 분리 및 16S rRNA 유전자 염기서열의 결정
DNA는 Qiagen Genomic DNA Isolation Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 분리하였고, polymerase chain reaction (PCR) 증폭은 Techne thermocycler(Bibby Scientific Limited, Stone, UK)로 수행하였다. PCR 반응혼합액은 1× buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin and 0.1% Triton X-100), 최종농도 200 μm의 deoxyribonucleotide triphosphates(dATP, dCTP, dTTP), 0.6 U Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 최종농도 2 μm의 정, 역방향의 primers [fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 rP2(5'-ACGGCT ACCTTGTTACGACTT-3')] 그리고 10 ng template DNA로 이루어졌다. PCR은 94oC에서 1분, 56oC에서 1분 그리고 72oC에서 2분간 30 cycles로 수행하였고, 반응 후 primer와 dNTP는 high pure PCR Product Purification Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 제거하였다. 정제된 PCR 산물은 pT7 blue Vector(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에 클로닝하여 Big Dye Terminator Kit와 ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 결정한 16S rRNA 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다. 종 유사성 결정을 위해 Clustral W 분석프로그램[24]을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다. Jukes와 Cantor[25] 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1,000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
선발균의 생리 · 생화학적 특성
선발 유용미생물의 생화학적인 특성을 조사하기 위하여 기본배지[26]에 다양한 종류의 탄소원과 질소원, 유기산 등을 0.1% (w/w)씩 첨가하여 생육정도를 조사하였으며, 부가적으로 API 20E, API 20NE, 50CH 키트(bioMerieux, Marcy-l'Etoile, France)를 사용하였고, Bergey’s manual of systematic bacteriology [27]에 준하여 실험을 하였다.
길항균의 세균성회색무늬병 방제효과 검정
세균성회색무늬병의 방제효과를 검정하기 위해 폿트(30 × 20 cm)에 재배된 양송이버섯을 실험에 사용하였다. 병원균은 R2A 배지[23]에 48시간 배양한 후 균체를 모아 250mL 멸균수가 든 삼각플라스크에 넣고 현탁하여 최종 농도가 5 × 106 되도록 조제하였다. 길항미생물은 액체 배양에 따른 배지의 영향을 최소화하기 위하여 R2A 배지[23]에 48시간 배양한 후 균체를 직접 모아 250 mL 멸균수가 든 삼각플라스크에 넣고 현탁하여 최종 농도가 5 × 107 되도록 조제하였다. 길항미생물의 항균효과를 검정하기 위하여 준비된 폿트에 병원균 현탁액 100 mL을 버섯 자실체에 먼저 분무처리한 후 30분 동안 과습한 발병환경을 조성한 후 길항 미생물 100 mL을 분무살포하여 온도 15oC, 습도 95%의 생육실에서 재배하면서 병 발생율을 조사하였다. 각 실험은 5반복으로 실시하였다.
발병율 및 방제가는 다음 식으로 계산하였다.
발병율 = 발병조사개체수/조사개체수 × 100
발병율 = (무처리발병율-처리발병율)/무처리발병율 × 100
결과 및 고찰
길항미생물 HC12의 선발
세균성회색무늬병을 일으키는 P. agarici에 대해 길항성을 나타내는 미생물을 선발하기 위하여 버섯 배지로부터 약 3,500균주의 미생물을 분리하여 길항력을 조사하였다. 그 결과 미생물 HC12가 가장 높은 길항력을 보였지만 대부분의 분리 미생물은 길항력이 없었거나 아주 약한 길항력을 보였다(Fig. 1). 국내에서는 세균갈색무늬병에 대한 길항미생물로 P. fluorescens [28], P. azotoformans [21] 그리고 이병원균이 분비하는 독소를 저해하는 Pseudomonas속[20]이 보고되어 있지만, 세균성회색무늬병 방제를 위한 생물학적 방제에 대한 연구는 없는 것으로 알고 있다. 실제적으로 길항미생물을 이용한 방제는 신속하고 정확한 방제 효과를 기대하기 어렵고, 병 발생 후의 치료 효과가 매우 낮으며 환경의 영향을 많이 받기 때문에 처리 효과가 일정하게 나타나지 않는 등의 단점으로 생물농약으로 실용화되지는 못하고 있는 실정이다.
길항미생물 HC12의 16S ribosomal DNA 분석
길항세균 HC12균주의 16S rDNA를 PCR 증폭에 의해 약 1.5 kb의 유전자를 확보하였으며, 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 Ribosomal Database Project를 이용하여 상동성을 분석한 결과 Alcaligenes sp.와 높은 유사성을 보였다. 또한 neighbor-joining 방법을 이용한 유연관계를 분석한 결과 길항균 HC12는 Alcaligenes속과 같은 그룹을 형성하였다(Fig. 2).
생리·생화학적인 특성
본 연구의 길항세균 HC12균주는 42oC에서 생육이 가능하며 아질산염의 환원과 gelatin의 액화를 시키지 못하였다. 그리고 L-histidine, L-tryptophan, L-ornithine, L-serine, malonate, valerate, propionate, N-acetyl glucosamin 등과 같은 산과 당을 이용하였고, urease, proline, potasslum gluconate 등은 이용하지 못하였다(Table 1).
생물 검정 효과
양송이버섯에 세균성회색무늬병균을 접종한 후에 HC12을 처리한 결과 무처리구에서는 68.5%의 이병율을 보였지만 HC12처리에서는 25.3%의 이병율을 보여 63%의 방제효과가 있었다. 이상의 결과로 HC12균주는 세균성회색무늬 병을 일으키는 양송이에 높은 항균효과가 있는 것으로 판단된다(Table 2, Fig. 3). Lee 등[20, 21]은 세균갈색무늬병원균의 분비독소를 저해하는 미생물인 Pseudomonas 속이 느타리, 팽이, 양송이 등에 55~69%의 방제효과를 보였고, P. azotoformans는 이들 버섯에 대해 71~69%의 높은 방제효과가 있었다고 보고하였다. 외국에서는 Nair와 Fahy[16]는 병원균 P. tolaasii에 대해 P. multivorans, P. fluorescens, Enterobacter aerogenes 등이 길항효과가 있었다고 보고하였다. 현재까지 국내에서는 세균성회색무늬병에 대한 생물적 제제가 개발되어 상품화된 것은 없다. 따라서 길항세균 HC 12 균주의 항균활성관여 물질탐색 및 최적 생산조건 검토, 농가 편의성을 고려한 제형화 기술개발과 살포방법 등을 추가적으로 개발한다면 산업적으로 충분히 가치가 있을 것으로 판단된다.
적 요
Pseudomonas agarici에 의해 발생하는 세균성회색무늬병은 양송이 재배에서 문제가 되는 대표적인 병해이다. 본 연구에서는 세균성회색무늬병의 생물학적 방제법에 이용할 수 있는 길항미생물의 항균활성과 선발된 길항미생물에 대해 폿트 수준의 생물검정 실험을 실시하였다. 재배중인 양송이 배지에서 세균성회색무늬병 병원균을 강하게 억제하는 길항세균 HC12를 선발하였으며, 생리·생화학적 실험과 유전적 실험결과 HC12균주는 Alcaligenes sp.로 동정되었다. Alcaligenes sp. HC12를 양송이에 처리한 결과 63%의 방제 효과를 보였다. 따라서 Alcaligenes sp. HC12가 양송이버섯 세균성회색무늬병 방제를 위해 합성농약을 대체할 수 있는 친환경 방제제가 될 수 있을 것으로 생각된다.
