Biocontrol of Ginseng Damping-off by Bacillus velezensis CC112

선발 미생물 보관

Bacillus velezensis CC112 균주는 춘천의 토마토 근권토양에서 분리하여 trypticase soy agar (TSA, Bacto Tryptone 15 g, Bacto Soytone 5 g, NaCl 5 g, agar 15 g/L) 배지에서 28oC에서 2일간 배양한 후 균체를 멸균한 글리세롤 20%액에 넣고 -20oC에 보관하면서 계대 배양하여 사용하였으며, 국립농업과학원에 기탁하여 KACC92129P 수탁번호를 받았다.

병원균 보관

인삼에 병원성을 가지는 Rhizoctonia solani와 Pythium sp. 균주는 potato dextrose agar (PDA, glucose 20 g, potato extract 4 g, agar 15 g/L) 사면배지에서 배양한 후 10oC 항온기에 보관하면서 사용하였다.

미생물 배양

Bacillus velezensis CC112 균주를 Luria-Bertani (LB, tryptone 10 g, yeast extract 5 g, NaCl 10 g), trypticase soy broth (TSB, Bacto Tryptone 15 g, Bacto Soytone 5 g, NaCl 5 g), King's B agar (KB, Peptone 20 g, K₂HPO₄ 1.5 g, MgSO₄· 7H₂O 1.5 g, Glycerol 15 ml), Bacillus-soytone medium (BSM, Soytone 0.5%, Sucrose 2%) 사용하여 각각의 배지에 미리 배양한 균주를 2% (v/v)으로 접종하여 25oC, 180 rpm으로 조절한 진탕배양기에서 48시간 후 배양액을 사용하였다.

B. velezensis CC112 균주의 식물병원균에 대한 항균활성 검정

식물병원균 Rhizoctonia solani, Pythium sp. Phytophthpora sp. Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea 균주를 PDA배지에 이식 후 Rhizoctonia solani, Pythium sp. Phytophthpora sp. 균주는 25oC, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea 균주는 20oC에서 각각 5~7일간 배양하여 직경 5 mm 코르크보러를 이용하여 병원균의 균총을 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬 중앙에 치상하였다. CC112 균주는 TSA 평판배지에 배양하여 루프를 이용하여 방선균을 떼어내어 PDA 배지가 분주된 일회용 페트리디쉬에 3개소에 치상하여 병원균별로 25oC와 20oC 항온기에서 7~10일간 배양 후 저지원의 직경을 조사하였다.

B. velezensis CC112 균주의 휘발성 물질에 의한 R. solani와 Pythium sp. 균주의 항균활성은 I 플레이트를 이용하여 TSA 배지와 PDA 배지를 분주하여 CC112균주를 TSA 배지에 도말하여 1일간 28oC에서 배양한 다음 PDA 배지에서 배양한 R. solani와 Pythium sp. 균총을 직경 5 mm 코르크보러를 이용하여 병원균의 균총을 PDA 배지가 분주된 I 플레이트에 치상하여 25oC에서 5일간 배양하여 조사하였다.

선발균주의 동정

선발균주의 동정을 위해 일반적으로 사용되는 16S rRNA 유전자의 염기서열을 사용하였으며, 추가로 Bacillus spp.의 분류에 유용한 것으로 알려진 DNA gyrase유전자(gyrB 유전자)의 염기서열을 이용하여 선발균주의 분류학적 위치를 분석하였다[18]. CC112 균주는 TSB (Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하여 30oC에서 24시간 이상 배양한 후 원심분리하여 균체를 수확하였다. Genomic DNA는 Genomic Plus DNA Prep kit (Inclone, Yongin, Korea)를 이용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자의 증폭을 위해 범용 프라이머인 27F와 1492R을 사용하였고, gyrB 유전자의 증폭을 위해 범용 프라이머인 UP-1과 UP-2r을 사용하여 PCR한 후 각각 유전자의 증폭산물을 얻었다[19, 20]. 3개의 프라이머(518F; CCAGCAGCCGCGGTAATACG, 800R; TACCAGGGTATCTAATCC, 984F; ACGCGARGAACCTTAC)를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 이용하고 gyrB 유전자는 두 개의 염기서열 분석용 프라이머(UP-1S; GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA, UP-2Sr; AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC)를 이용하여 분석하도록 제노텍(Geno-Tech, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. 얻어진 염기서열은 SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 직접 오류를 검정하고 연결하였다. 각 유전자의 비교분석을 위해서 16S rRNA 유전자의 염기서열 및 균주간 상동성은 EzTaxon (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)을 통해서 얻었으며[21], gyrB 유전자의 염기서열은 GenBank (www.ncbi.nlm.nih/genbank)를 통하여 얻었다. 계통도의 작성을 위해 MEGA 5.0 프로그램의 Clustal W 프로그램으로 염기서열을 정렬하고 염기서열 길이를 맞추었다. 계통도를 작성하기 위해 neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 계통도의 신뢰성을 확보하기 위해 1,000회 반복 bootstrapping을 수행하였다[22].

Table 1. Antifungal activity of Bacillus velezensis CC112 on fungal pathogens of ginseng incubated at 28oC for 6 days on PDA agar

PDA, potato dextrose agar.

Fig. 1. Inhibition effect of mycelial growth of Rhizoctonia solani (A), Pythium sp. (B), Sclerotium cepivorum (C), Sclerotinia sclerotiorum(D), Phytophthora sp. (E) and Botrytis cinerea (F) by Bacillus velezensis CC112.

방선균의 인삼 잘록병 방제 효과 검정

상자(500 × 300 × 150 mm)에 인삼재배용 상토(Shinsung Mineral, Goesan, Korea)를 사용하여 개각 인삼 종자를 상자당 54립씩 3반복으로 파종하였다. 병원균 R. solani와 Pythium sp. 균주의 배양은 PDA 배지에 배양한 후 보리배지에 균총을 이식하여 25oC에서 15일간 배양하여 접종원으로 사용하였다.

CC112균주의 배지종류별 배양액의 R. solani와 Pythium sp. 균주에 대한 방제효과 검정

종자침지처리는 CC112균주의 LB, KB, BSM 배지에 28℃에서 2일간 180 rpm으로 진탕배양한 각각의 배양액을 10배 희석하여 인삼 개각 종자를 1시간 침지한 후 파종하였다. 그리고 관주처리는 인삼 개각종자를 침지처리하여 파종한 다음 균주별 배양액을 10배로 희석하여 주당 10 mL 씩 7일 간격 6회 관주처리하였다. 모든 처리에서 3반복으로 하였으며, 병원균의 접종은 병원균 R. solani와 Pythium sp. 균주를 각각 배양한 보리를 상자당 0.5 g/상자 접종하였고, 최종 6회 처리 7일 후 이병주를 조사하였다.

CC112균주 시제품의 R. solani와 Pythium sp. 균주에 대한 방제효과 검정

CC112균주 시제품은 벤토나이트를 증량제로 사용하여 9.2 × 10⁷/g로 제조한 시제품을 충남대학교로부터 받아서 실험하였다. 종자 침지처리구는 시제품을 50배와 100배로 각각 희석하여 개각종자를 1시간 침지하여 상자에 파종하였다. 또한 관주처리구는 인삼 개각종자를 상자에 파종한 다음 시제품을 50배와 100배로 각각 희석하여 주당 10 mL씩 처리하였고, 7일 간격 3회 토양에 관주처리하였다. 병원균의 접종은 병원균을 각각 배양한 보리를 종자 파종 12일 후에 상자당 8개씩 접종하였다. 인삼종자의 발아율은 파종 20일후 조사하였으며, 인삼 잘록병 발생은 파종 40일 후에 이 병주를 조사하였다.

B. velezensis CC112 균주의 식물병원균에 대한 항균활성

식물병원균 Rhizoctonia solani, Pythium sp., Phytophthpora sp., Sclerotium cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea에 대한 B. velezensis CC112 균주의 균사 생장 억제를 조사한 결과, R. solani에 대하여 17.0 mm, Pythium sp.에 대하여 초기에는 억제효과가 있었으나 Pythium sp.의 균사가 재생하여 저지원이 거의 없어졌다. 그리고 Phytophthpora sp.에는 15.1 mm, Sclerotium cepivorum에는 12.2 mm, Sclerotinia sclerotiorum에는 13.0 mm, Botrytis cinerea 균에 대하여 5.6 mm의 저지효과를 나타내었다(Table 1, Fig. 1). 또한 B. velezensis CC112 균주의 휘발성 물질생성에 의한 R. solani와 Pythium sp.의 균사 생육 억제 효과를 조사한 결과에서는 잘록병균에 대하여 억제 효과는 없었다. B. velezensis CC112 균주가 R. solani 등 여러 식물병원균에 대하여 항균활성을 나타낸 것은 식물병 방제와 관련이 있는 바실러스 균주의 이차대사산물 중 cyclic lipopeptides (bacillomycin D, fengycin, iturin, surfactin), a dipeptide (bacilysin), siderophore (bacillibactin), polyketides (bacillaene, difficidin, and macrolactin) 등이 생합성 관련 유전자를 보유하고 있는 것[17]으로 추정되며 이를 확인하기 위하여 유전체 분석이 필요하다.

선발 균주의 동정

16S rRNA와 gyrB 유전자를 바탕으로 MEGA5 프로그램을 이용하여 분자유전학적인 계통도를 작성하고 선발 균주의 분류학적 위치를 확인하였다(Fig. 2). 16S rRNA 유전자를 바탕으로 작성한 계통도에서 CC112 균주는 Bacillus velez 2Aensis BCRC 17467(T) 및 B. methylotrophicus KACC 13105(T) 균주와 높은 상동성(100%)을 보였다(Fig. 2A). 계통도의 신뢰성을 확보하기 위한 bootstrap 값도 89%로 비교적 높은 값을 보였다. CC112 균주는 gyrB 유전자를 바탕으로 작성한 계통도에서 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum 균주에 높은 상동성(100%)을 보였으며, 99%의 Bootstrap 값을 보이며 높은 계통도의 신뢰성을 보였다(Fig. 2B). 최근 계통유전체학을 바탕으로 한 Bacillus spp.의 분류연구에 의하면 근연종인 Bacillus 4종, 즉 B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, B. methylotrophicus, B. oryzicola, 및 B. velezensis를 모두 B. velezensis로 분류되어야 한다고 보고되었다[23]. 본 연구의 선발 균주인 CC112 균주는 16S rRNA 유전자와 gyrB 유전자를 이용하여 분석한 결과 Dunlap 등[23]의 보고에 따라 B. velezensis로 동정되었다.

Fig. 2. Neighbor-joining phylogenetic tree based on partial 16S rRNA (A) and gyrB (B) gene sequences (1,416 bp and 1,065 bp, respectively) of Bacillus strains. Numbers above branches indicate bootstrap values (> 50%) from 1,000 replicates. Strain or culture collection and accession numbers are indicated next to species name. T means type strain.

CC112균주의 배지종류별 배양액의 R. solani와 Pythium sp. 균주에 대한 방제효과

LB, KB와 BSM 배지에서 배양한 CC112 균주의 배양액을 10배로 희석하여 종자침지처리와 종자침지+토양관주처리한 결과는 LB 배지와 BSM 배지의 배양액이 KB 배지 배양액보다 방제 효과가 높았다. 종자 침지처리 경우에는 LB 배지가 65.8%, KB 배지는 26.7%, BSM 배지는 67.1%, 종자침지와 토양관주를 같이 처리하였을 때 LB 배지가 64.2%, KB배지가 24.4%, BSM 배지가 53.7% 방제효과를 각각 나타내었다(Table 2). 이 결과를 분석하면 종자를 파종할 때 1회 침지처리만 한 구가 종자침지 1회와 토양관주 6회 처리한 구보다도 종자침지처리구가 방제 효율이 높은 것으로 나타났다.

Table 2. Control effect of cultured broth of Bacillus velezensis CC112 at several media for ginseng damping-off caused by Rhizoctonia solani

LB, Luria-Bertani; KB, King's B agar; BSM, Bacillus-soytone medium.

^a) In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.

CC112균주 시제품의 R. solani와 Pythium sp. 균주에 대한 방제효과

CC112균주의 시제품을 50배와 100배로 각각 희석하여 R. solani에 대하여 처리한 결과, 토양관주가 종자침지처리보다 방제효과가 높으며, 50배액 종자의 침지처리가 30.7%, 100배액의 종자침지가 47.2%로 낮은 방제효과를 보였으나, 토양관주처리한 구에서 50배 희석액은 52.3%와 100배 희석액은 77.3% 방제효과를 나타냈다(Table 3, Fig. 3).

Table 3. Control effect of the prototypes of Bacillus velezensis CC112 for ginseng damping-off caused by Rhizoctonia solani

^a) In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.

Fig. 3. Control effect of treatments of the prototype of Bacillus velezensis CC112 for ginseng damping-off caused by Rhizoctonia solani. A, Seed dipping (50 times); B, Seed dipping (100 times); C, Soil drenching (50 times); D, Soil drenching (100 times); E, Untreated check.

Pythium sp.에 대해서도 R. solani에 대하여 처리 결과와 같이 토양관주가 종자침지처리보다 방제효과가 높다. 종자침지처리구가 38.3~39.1% 방제효과를 보인 반면에 토양관주 50배 처리가 56.5%, 토양관주 100배처리가 65.7%의 방제효과를 나타냈다(Table 4, Fig. 4).

Table 4. Control effect of the prototype of Bacillus velezensis CC112 for ginseng damping-off caused by Pythium sp.

^a) In a column, means followed by a common letter are not significantly different at the 5% level by Duncan’s multiple range test.

Fig. 4. Control effect of treatments of the prototype of Bacillus velezensis CC112 for ginseng damping-off caused by Pythium sp. A, Seed dipping (50 times); B, Seed dipping (100 times); C, Soil drenching (50 times); D, Soil drenching (100 times); E, Untreated check.

이상의 결과에서 인삼 잘록병균 R. solani와 Pythium sp. 에 대하여 CC112 균주의 시제품은 종자침지보다는 토양관주처리가 효과적이었으며, 100배액 관주처리가 50배액 관주처리보다 높은 65.7~77.3% 방제하였다.

Yang 등[15]은 B. stearothermophilus를 이용하여 탈크, 제오라이트, 벤토나이트, 벤토나이트+탈크, 탈크+제오라이트, 벤토나이트+제오라이트 제제를 만들어서 오이 잘록병균(Pythium aphanidermatum)이 처리된 상토 혼화처리한 결과에서 탈크, 제오라이트, 벤토나이트 각각의 단제는 45~55%, 두 보조제를 혼합한 벤토나이트+탈크, 탈크+제오라이트, 벤토나이트+제오라이트 제제는 단제보다 높은 58~70%의 방제효과를 나타내었으며, 화학살균제와 비교시에도 비슷한 방제 효과를 나타내었다고 하였다. CC112 균주의 벤토 나이트 제품과 비교하면 토양관주 100배액 처리가 77.3%로 나타나 B. stearothermophilus 균주보다 높은 방제 효과를 보여서 제품으로 개발 가능성을 보여주었다. 그리고 미생물제품 Serenade (B. subtilis QST713)를 9배 희석하여 관주처리하여 R. solani에 의한 고추와 오이의 잘록병을 58%와 54% 방제 효과를 각각 나타냈으며, 같은 방법으로 P. ultimum에 의한 고추와 오이의 잘록병에 57%와 7.7% 방제효과를 나타냈다[16], CC112 균주의 시제품 100배액 관주처리가 Serenade보다 높은 잘록병균 R. solani와 Pythium sp.에 높은 방제효과를 나타내어 잘록병 방제에 우수한 균주라 생각된다.

이와 같이 CC112 균주는 Rhizoctonia solani와 Pythium sp.에 대하여 항균활성이 있어서 방제가 곤란한 토양병해 인삼 잘록병에 방제 효과를 나타내어 화학농약을 대체할 수 있는 친환경 인삼 잘록병 방제제로서 개발할 필요가 있다고 생각된다.