제주도는 전북식물구계(Haloartic floristic kingdom)에 속하며, 난대, 온대, 아고산대에 이르는 다양한 기후조건으 로 인하여 풍부한 식물상을 가지고 있는 식물지리학적으로 매우 중요한 섬이다[1]. 제주도에 서식하는 식물 종의 분포 등에 관한 연구[2, 3]와 더불어 오늘날에는 기후변화로 인 한 지구 온난화의 영향에 취약한 고산, 아고산 등의 일부 생태계에 관한 연구도 활발히 진행되고 있다[4]. 그러나 거시적 관점에서의 식물 종에 대한 연구는 활발히 진행되고 있으나, 식물과 공진화 과정을 통해 공생관계를 형성해온 다양한 내생균류에 관한 연구는 거의 미미한 실정이다[5]. 내생균은 식물의 건강한 조직에 서식하고 있는 균류로, 일 반적으로 조직 내에서 병증을 나타내지 않는 균류를 말하 며[6], alkaloids, steroids, terpenoids, flavonoids 등과 같은 다양한 생리활성물질의 합성이 가능하다고 보고되고 있다 [7]. 따라서, 생물 다양성을 확보하기 위한 생물자원으로서 식물에 공생하는 내생균을 발굴하는 것은 시급한 실정이다. 이에 본 연구에서는 제주도에 서식하는 목본식물에서 다양 한 내생균을 분리하여 형태적·분자적 동정을 통해 확인된 10종의 미기록 내생균을 보고하고자 한다.
제주도 사려니숲(N 33° 25' 23", E 126° 37' 36")에서 편 백나무(Chamaecyparis obtuse (Siebold et Zucc.) Endl.), 삼 나무(Cryptomeria japonica D. Don), 비자나무(Tor reya nu- cifera Siebold et Zucc.), 꽝꽝나무(Ilex crenata Thunb.)를, 동백동산(N 33° 30' 52", E 126° 43' 07")에서 동백나무(Ca- mellia japonica L.)의 잎을 채집하였다. 병증이 없는 잎을 무작위적으로 선별하여 24시간 내에 Richardson 등[8]의방법을 이용하여 균을 분리하였다. 표면 살균을 위해 무균 실험대에서 70% 에탄올과 3% 차아염소산나트륨(NaClO) 용액을 차례로 처리하고, 멸균수로 세척한 후 멸균된 거름 종이로 물기를 제거하였다. 이후 잎은 멸균된 가위를 이용 하여 1 mm 크기로 자른 후 potato dextorose agar (PDA) 배지에 치상하였으며, 25o C 암소에서 배양하면서 발생한 균주를 계대배양하였다. 순수 분리된 균주는 25o C 암소에 서 7일간 배양하며, 균총의 생장속도, 색, 모양, 고도 등의 형태학적 특징을 관찰하였으며, 이후 슬라이드 배양법을 통해 균사와 포자를 관찰하였다. 분자생물학적 동정을 위 하여 DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 균주의 Genomic DNA를 추출하였으며, 이를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하 였다. Primer ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcri- bed spacer (ITS) 영역[9]을, primer LR0R과 LR16을 이용 하여 ribosomal DNA의 large subunit (LSU) 영역[10]을, 그리고 primer Bt2a과 Bt2b를 이용하여 β-tublin 영역[11] 을 증폭하였다. PCR 조건 중 annealing 온도는 ITS 영역은58 oC, LSU 영역은 54oC, β-tublin 영역은 54o C로 설정하여수행하였다. LSU 영역과 β-tublin 영역은 NCBI에 등록된 염기 서열이 있는 종에 한해서 분석을 실시하였다. PCR 산 물은 1.5% agarose gel에서 20분간 전기영동하였으며, 예상 되는 크기의 band를 추출하여 정제한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). 분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종 들 간의 계통관계 분석을 위해 MEGA6 [12]를 이용하여 neighbor-joining 방법으로 계통수를 완성하였다(Fig. 1 ~3).
Mycosphaerella aleuritidis (I. Miyake) S. H. Ou, Sinen- sia, Shanghai 11: 183 (1940)
Malt extract agar (MEA) 배지에서 7일간 배양 시 직경 19~22 mm이고(Fig. 4A), PDA 배지에서 배양 시 직경 20 ~23 mm 크기로 자랐다(Fig. 4B). PDA에서 자란 균총의 표 면부는 처음에 갈색을 띠고 있었으나, 시간이 지날수록 검 은색으로 변하여, 많은 양의 삼출물이 나타났다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 M. aleuritidis KC281 386과 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대한 염기서열 을 분석한 결과 M. aleuritidis EU167594와 98% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36" 2015년 7월 1일, 편백나무(Chamaecyparis obtuse (Siebold et Zucc.) Endl.)의 침엽, 15B481(NIBRFG0000194889)
Fig. 4
Colony of strain 15B481 (Mycosphaerella aleuritidis) grown on MEA (A) and PDA (B) for 7 days at 25 oC; Colony of strain 15B710 (Neofusicoccum eucalyptorum) grown on MEA (C) and PDA (D) for same conditions; Colony of strain 15B660 (Neofu- sicoccum parvum) grown on MEA (E) and PDA (F) for same conditions; Colony of strain 15B637 (Phyllosticta citrichinaensis) grown on MEA (G) and PDA (H) for same conditions; Colony of strain 15B650 (Phyllosticta cryptomeriae) grown on MEA (I) and PDA (J) for same conditions; Colony of strain 15B219 (Phomopsis cotoneastri) grown on MEA (K) and PDA (L) for same conditions; Colony of strain 15B520 (Sphaerulina rhododendricola) grown on MEA (M) and PDA (N) for same conditions; Col- ony of strain 15B455 (Guignardia mangiferae) grown on MEA (O) and PDA (P) for same conditions; Colony of strain 15B460 (Lophodermium jiangnanense) grown on MEA (Q) and PDA (R) for same conditions; Colony of strain 15B436 (Lophodermium minor) grown on MEA (S) and PDA (T) for same conditions. MEA, malt extract agar; PDA, potato dextorose agar.
Phyllosticta citrichinensis X. H. Wang, Chen, Huang, Zhang, K. D. Hyde &H. Y. Li, Fungal Diversity Res. Ser. 52(1): 215 (2012)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 23~25 mm이고(Fig. 4G), PDA 배지에서 배양 시 직경 24~29 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4H). 균총의 모양은 불규칙하며, 가장자리에 환대 를 가지고 있고, 균총 사이에 깊은 홈이 발달해 있다. 현미 경으로 관찰한 결과 점액성 보호막을 가지고 있는 포자가 관찰되었으며, 그 크기는 8~12 × 6~7 μm 정도이다(Fig. 5A). Phyllosticta citrichinensis는 다른 Phyllosticta속의 균주 보다 긴 장축을 가지고 있는 것이 특징이며[13], 본 연구에 서도 12 μm 정도의 장축을 가진 포자가 많이 관찰되었다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 P. c i t r i chi - naensis JN791598과 98% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36" 2015년 7월 1일, 삼나무(Cryptomeria japonica D. Don)의 침엽, 15B637(NIBRFG0000194895)
Neofusicoccum eucalyptorum (Crous, H. Sm. ter & M. J. Wingf.) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips 2006
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 43~45 mm이고(Fig. 4C), PDA 배지에서 배양 시 직경 59~65 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4D). 균총의 중심에는 균사가 밀집되어 있으며, 중 심에서 가장자리로 갈수록 균사가 성기게 형성되어 있고, 공중균사가 발달해있다. 이 균주의 ITS 지역의 염기서열을 분석한 결과 N. eucalyptorum KC479188과 99% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36", 2015년 7월 1일, 편백나무(Chamaecyparis obtuse (Siebold et Zucc.) Endl.)의 침엽, 15B710(NIBRFG0000194901)
Neofusicoccum parvum (Pennycook & Samuels) Crous, Slippers & A. J. L. Phillips 2006
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 63~65 mm이고(Fig. 4E), PDA 배지에서 배양 시 직경 65~66 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4F). 흰색의 균사가 조밀하게 모여있는 것이 특징이 며, 공중균사가 발달했고, 삼출물은 없다. 이 균주의 ITS 영 역의 염기서열을 분석한 결과 N. parvum EF638786과 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는N. parvum KT 189496과 94% 상동성을 보였고, β-tublin 영역에 대해서는 N. parvum KR260807과 98% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36", 2015년 7월 1일, 삼나무(Cryptomeria japonica D. Don)의 침엽, 15B660(NIBRFG0000194899)
Phyllosticta cryptomeriae Kawam., Bull. Govt Fore Exp. Stn Meguro 10: 97 (1913)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 22~26 mm이고(Fig. 4I), PDA 배지에서 배양 시 직경 17~20 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4J). 균총이 처음 형성될 때에는 연한 노란색을 띠 고 있었으나, 시간이 지남에 따라 짙은 회색의 균사로 변하 며, 균총이 불규칙한 형태를 띠고 있다. 이 균주의 ITS 영역 의 염기서열을 분석한 결과 P. c r y p t ome r i a e AB454271과 99% 상동성을 보였으며, β-tublin 영역에 대해서는 P. c r y p - tomeriae AB704257과 92% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36", 2015년 7월 1일, 삼나무(Cryptomeria japonica D. Don)의 침엽, 15B650(NIBRFG0000194896)
Phomopsis cotoneastri Punith., Trans. Br. mycol. Soc. 60(1): 157 (1973)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 71~72 mm이고(Fig. 4K), PDA 배지에서 배양 시 직경 61~62 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4L). 균총의 생장속도가 매우 빠르며, 흰색의 균사 체가 물결모양을 형성하고 있고 변연부는 불규칙한 형태를 띠고 있다. Phomopsis속은 alpha형 포자와 beta형 포자를 만드는 원통형의 경자(phialide)가 들어 있는 검은색의 분 생자과(conidiomata)를 가지고 있는 것이 특징[14]이며, 본 연구에서도 현미경으로 포자를 관찰한 결과, 크기 1~1.5 × 3~4 μm 정도의 alpha형 분생포자(conidiophore)가 관찰되 었고, 크기 1 × 24~28 μm의 beta형 포자도 관찰되었다 (Fig. 5B). 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 P. cotoneastri FJ889450과 99% 상동성을 보였으며, β-tublin 영역에 대해서는 P. cotoneastri KC763119와 99% 상동성을 보였다.
Fig. 5
Conidiophore and conidia (A) of strain 15B637 (Phyllosticta citrichinaensis); α-conidia (arrow) and β-conidia (arrow) (B) of strain 15B219 (Phomopsis cotoneastri); ascospore (C) of strain 15B520 (Sphaerulina rhododendricola); conida (D) of strain 15B455 (Guignardia mangiferae) (scale bars = 10 μm).
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36", 2015년 7월 1일, 비자나무(Tor reya nuc i fe ra Siebold et Zucc.)의 침엽, 15B219(NIBRFG0000194880)
Sphaerulina rhododendricola Crous & Cheew., in Crous et al., Persoonia 31: 243 (2013)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 11~12 mm이고(Fig. 4M), PDA 배지에서 배양 시 직경 11~13 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4N). 균총의 생장속도가 매우 느리며, 중심부가 시 간이 지남에 따라 짙은 회색의 균사체를 형성한다. 포자를 현미경으로 관찰한 결과 중앙에 한 개의 격벽을 가진 자낭 포자(ascospore)가 높은 밀도로 관찰되었으며, 크기는 1~ 1.5 × 6~9 μm 정도이다(Fig. 5C).
이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 S. rhododen- dricola KF777187과 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 S. rhododendricola KF779483과 99% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 사려니숲, N 33°25'23", E 126°37'36", 2015년 7월 1일, 꽝꽝나무(Ilex crenata Thunb.)의 잎, 15B 520(NIBRFG0000194890)
Guignardia mangiferae A. J. Roy, Indian Phytopath. 20 (4): 348 (1968)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 32~35 mm이고(Fig. 4O), PDA 배지에서 배양 시 직경 45~47 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4P). MEA 배지에서 자란 균총의 중심부는 군청색 을 띠고 있으며, 변연부는 흰색의 띠를 형성하고 있다. 또 한 균총의 가장자리에는 원형의 깊은 홈이 형성되어 있다. PDA에서 자란 균총은 동심원의 띠를 형성하며, 뚜렷한 층 을 형성한다. 현미경으로 포자를 관찰한 결과 8~9 × 9~10 μm 크기의 포자가 관찰되었으며, 포자 표면에 여러 갈래의 불규칙한 홈이 형성되어 있다(Fig. 5D). 이 균주의 ITS 영 역의 염기서열을 분석한 결과 G. mangiferae EU273524와 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 G. mangi-ferae KF955298과 98% 상동성을 보였다.
관찰표본: 제주도 동백동산, N 33°30'52", E 126°43'07", 2015년 7월 1일, 동백나무(Camellia japonica L.)의 잎, 15B 455(NIBRFG0000194886)
Lophodermium jiangnanense Y. R. Lin & S. J. Wang, in Lin, Xu, Yie & Wang, Mycosystema 23(1): 15 (2004)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 16~20 mm이고(Fig. 4Q), PDA 배지에서 배양 시 직경 15~32 mm 크기로 자랐다(Fig. 4P). 균총은 불규칙한 형태를 띠고 있으며, 방사형 의 홈이 깊게 형성된다. MEA에서 자란 균총의 중심부에는 흰색의 균사체가 형성된다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열 을 분석한 결과 L. jiangnanense GU138714와 99% 상동성 을 보였다.
관찰표본: 제주도 동백동산, N 33°30'52", E 126°43'07", 2015년 7월 1일, 동백나무(Camellia japonica L.)의 잎, 15B 460(NIBRFG0000194887)
Ophodermium minor (Tehon) P. R. Johnst., Sydowia 41: 174 (1989)
MEA 배지에서 7일간 배양 시 직경 12~18 mm이고(Fig. 4S), PDA 배지에서 배양 시 직경 11~12 mm 크기로 자랐 다(Fig. 4T). 연한 노란색의 균총이 불규칙하게 형성되며, 공중균사가 발달해 있고, PDA 배지에서 배양한 균총은 생 장속도가 느리다. 이 균주의 ITS 영역의 염기서열을 분석한 결과 L. minor GU138719와 99% 상동성을 보였으며, LSU 영역에 대해서는 L. minor HM140570과 98% 상동성을 보 였다.
관찰표본: 제주도 동백동산, N 33°30'52", E 126°43'07", 2015년 7월 1일, 동백나무(Camellia japonica L.)의 잎, 15B 436(NIBRFG0000194885)
현재 내생 균류의 숙주 특이성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이를 통해 숙주가 내생균류의 군집구조에 큰 영향을 미친다는 사실은 오래 전부터 밝혀졌다[15]. 그 러나 현재 우리나라에서는 숙주에 따른 내생균의 군집 구 조와 특이성에 관한 연구가 부족한 실정이다[16, 17]. 따라 서 내생균의 군집구조에 관한 연구뿐만 아니라, 생물자원 으로서 내생균류의 종 다양성을 확보하기 위한 측면에서도 내생균의 분리 및 동정에 관한 지속적인 연구가 필요할 것 이다.
Aquanectria penicillioides (Ingold) L. Lombard & P.W.Crous, Stud. Mycol. 80:207 (2015)
Aquanectria penicillioides는 Flagellospora penicillioides로 ngold [13]에 의해 최초로 보고되었으나, 이후 Lombard 등[14]에 의해서 Aq. penicillioides로 재명명되었다. NNIB RFG19 균주는 강원도 삼척시 소한천의 담수침전식물체 시 료에서 분리되었다. 이 균주의 ITS rDNA 부분 염기서열을 NCBI에 등록된 염기서열과 비교하여 분석한 결과, Aq. penicillioides (GenBank Accession number KM231743)와 99.5%(547/550 bp)의 상동성을 보였다(Fig. 1).
NNIBRFG19 균주를 MEA 배지에 배양했을 때 15oC에서 7일 동안 40 mm 정도로 생장하였으며, 균사체는 가운데 부 분이 연노란색을 띄고 가장자리로 갈수록 흰색을 보였다. Aq. penicillioides는 약간 S자 모양으로 구부러진 길고 가는 형태의 투명한 포자를 가지고 있으며, 크기는 길이는 30~ 40 μm, 너비는 2~3 μm이었다(Table 1; Fig. 2C). NNIBRF G19 균주는 광조건과 암조건 모두에서 3일이 지난 후부터 포자를 생성하였다(Fig. 3C).
적요
본 연구는 제주도 사려니숲과 동백동산에서 편백나무 (Chamaecyparis obtusa), 삼나무(Cryptomeria japonica), 비 자나무(Tor reya nuc i fe ra), 꽝꽝나무(Ilex crenata), 동백나무 (Camellia japonica) 등 5종의 목본 식물의 잎에서 내생균을 분리하고, 형태 및 분자생물학적 특징 통해 동정하였다. 이 를 위해 primer인 ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal tran- scribed spacer (ITS) rDNA영역과 primer LR0R과 LR16을 이용하여 large subunit rDNA 영역을 그리고 primer Bt2a 과 Bt2b를 이용하여 β-tublin 영역의 염기서열을 동시에 분 석하였다. 그 결과 Mycosphaerella aleuritidis, Neofusicoc- cum eucalyptorum, Neofusicoccum parvum, Phyllosticta cit- richinensis, Phyllosticta cryptomeriae, Phomopsis cotoneas- tri, Sphaerulina rhododendricola, Guignardia mangiferae, Lophodermium jiangnanense, Lophodermium minus 등 10 종의 미기록 내생균을 동정하였고, 이를 보고하고자 한다.
