서론
국내의 식용버섯 생산량은 614,224 톤/년에 달하며 느타 리버섯(Pleurotus ostreatus), 큰느타리버섯(P. eryngii), 팽이 버섯(Flammulina velvtipes)이 주요 생산 버섯으로 생산량 의 88%를 차지한다[1]. 버섯은 배양 중에 면역활성, 항암,항염증, 항산화 등의 다양한 생리 활성 물질을 생산한다 [2]. 특히, 담자균류의 자실체 또는 균사체로부터 다양한 종 류의 세균, 진균에 대해 항균활성물질이 분리 동정된 바 있 으며 주로 인체, 또는 동물 관련 미생물을 대상으로 하고 있다[3]. 일반적으로 곰팡이로부터 항균활성물질의 대량생 산을 위하여 고체배양법인 solid state fermentation (SSF) 와 액체배양법인 submerged fermentation (SF)이 사용되고 있으며 농산 폐자원을 이용한 SSF 방법이 항균활성 물질 생산에 적용된 바 있다[4, 5]. 식용버섯은 선제적으로 인체 에 무해하므로 친환경 농업 적용에 유용하나 적은 비용으 로 생리 활성 물질을 대량생산 적용하는 것이 관건이다. 큰 느타리버섯(Pleurotus eryngii), 표고버섯(Lentinula edodes), 잎새버섯(Grifola frondosa), 버들송이버섯(Agrocybe cylindracea) 민자조방망이 버섯(Clitocybe nuda) 등 식용버섯의 균사배양체 배양여액을 이용한 식물 병원 진균 및 세균에 대한 항균활성이 탐색하고 고추역병에 대한 식물병 방제에 적용된 바 있다[6]. 그러나 균사체 배양은 별도의 대량배양 시스템과 고가의 추출장비 등이 필요하여 농업적으로 활용하기에는 경제적 부담이 있다.
대체 원료로 버섯 수확 후 배지(spent mushroom sub- strate, SMS)를 고려할 수 있으며 이는 버섯을 수확하고 버 려지는 자원으로 SSF와 유사한 특성을 가지고 있어 별도의 균 배양 단계 없이 추출 용매 첨가만으로 간단하게 추출물 을 확보할 수 있어 저비용 고효율로 활용 가치가 높다.
버섯 생산에 사용되는 배지는 톱밥, 콘코브, 면실박 등 농 산 잔여물을 가공하여 사용하고 있으며 종균이 접종되면 균사 성장 영양단계와 자실체 생산 생식 단계를 거치며 수 확 후 배지 내에는 목질 분해 효소와 식물 생육 촉진 유효 성분, 항균물질, 병 저항성 유도체 등 다양한 생리 활성 물 질을 생산한다[7]. SMS는 퇴비, 가축사료와 식물병 방제를 위한 부가가치 재료로 활용된 바 있으며[7] 국내에서 SMS 를 이용한 식물병 방제로 항균활성을 가지는 노루궁뎅이 버섯 SMS 물 추출물을 이용한 고추역병과 토마토 풋마름 병 방제가 보고된 바 있다[8, 9]. 큰느타리버섯은 우리나라 주요 식용버섯으로 생산량이 급속히 증가되어 연간 4만 4 천여 톤이 생산되고 있으며[1] 버섯 생산 kg당 5 kg의 배지 가 사용되는 것을 감안할 때 20만 톤 이상의 큰느타리 SMS 가 생산될 것으로 추정된다. 토마토 풋마름균(Ralstonia solanacearum)은 토양 병원균으로 뿌리나 기저부의 줄기에 생긴 상처를 통하여 침입하여 도관을 막아 푸른 채로 말라 죽게 하며 우리나라에는 다양한 생리형과 병원형균이 분포하고 있다[9-11]. 국내 토마토는 대부분 비닐하우스에서 재 배되기 때문에 발병의 빈도가 높으며 토마토 풋마름병은 토양전염성으로 감염되면 고랑을 따라 급속하게 전이되어 치료가 거의 불가능하며 매년 피해 면적이 15~25%에 이르 고 있다. 세균병의 방제 전문 농약은 항생제와 구리를 포함 한 동제로 매우 제한적이고 고가의 수입 약제에 의존하며 토양 처리 시 약해, 약제 내성 및 환경오염 우려가 있다. 본 연구는 국내 주요 생산 버섯 큰느타리버섯의 수확 후 배지를 이용하여 토마토 풋마름병균의 방제효과, 병 저항 성 유도 및 식물 생장촉진 효과를 조사하여 큰느타리 수확 후 배지의 농업적 활용성을 제고하고자 한다.
재료 및 방법
버섯 수확 후 배지 물 추출
큰느타리 SMS는 큰느타리버섯 재배농가로부터 분양받 아 사용하였다. 그 SMS로부터 유효성분을 추출하기 위하 여 SMS:물(1:5 w/v) 비율로 하여 1시간 동안 90 oC에서 열 처리하였다. SMS 혼합액을 2겹의 미라크로스로 거르고 7,000 × g에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 SMS 물 추출물(water extract from spent mushroom substrate, WESMS)로 하여 실험에 사용하였다.
토마토 풋마름병 검정
토마토(품종: 슈퍼도 네랑) 파종 후 20일 된 유묘를 사용하였다. 처리 방법은 1차로 큰느타리 WESMS 30 mL를 토 마토 모종에 관주하고 3일 후 토마토 풋마름균(Ralstonia solanacearum)을 접종하였다. 접종방법은 토마토 유묘 뿌리 를 가위로 일부 상처를 준 후 토마토 풋마름균 2 × 10 6 세포 현탁액 5 mL를 뿌리 주변에 접종하였다. 접종 후 3일 후에 WESMS 30 mL를 2차 관주 처리하고 5일 후에 3차 추출물 을 관주 처리하였으며 병 방제효과는 최종 처리 토마토 풋 마름병 접종 후 15일 후에 관찰하였다. 양성 대조군 DL-3- aminobutylic acid (BABA) 0.5%와 음성대조군 물이 상기 방법에 준하여 처리되었다. 발병 정도(disease index)는 Kwak 등[9]이 제시한 1: 잎이 10~20%, 2: 20~50% 전체 식 물체가 시듦, 3: 50~70% 식물체가 시듦, 4: 식물체가 70~ 100% 이상 시듦으로 표시하였으며 방제율은 Sunwoo 등 [12]이 제시한 100 (1-x/y, x는 처리구 발병 정도, y는 비 처 리구 발병 정도)식으로 산출하였다.
토마토 식물체로부터 페놀성분 및 salicylic acid 함량분석
SMS 열수추출물 50 mL를 포트에 성장한 토마토 유묘(4 주)에 관주 처리하여 96시간 경과 후 Hassan 등[13]에 의한 방법에 의하여 페놀 성분을 추출하였다. 처리별 토마토 잎 1 g을 액체질소에 마쇄하였으며 3 mL의 90% methanol로 혼합하고 원심분리하여 분배하였다. 상층 분배체를 감압 농축기로 농축하여 잔여물을 5% trichloroacetic acid (Sig- ma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5 μL와 99% methanol (w/v)의 혼합물을 첨가하여 녹이고 이어서 증류수 5 mL를 첨가하여 원심분리하여 상등액을 페놀 성분과 salicylic acid (SA) 함량 조사하는데 활용하였다. 토마토 페놀 추출물 600 μL를 500 μL, 7% Folin Ciocalteu regent와 혼합하고 4% Na2CO3 500 μL를 첨가하여 60분 후에 spectrophotometer 로 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 garlic acid를 페놀 성분 standard로 하여 정량분석 하였다.
Salicylic acid 함량조사를 위하여 상기 추출물 500 μL를 Liquid chromatograph Mass Spectrometer (LCMS8050; Shimadzu, Kyoto, Japan)로 제공된 사용지침에 따라 분석하 였다. Colume은 Kinetex c18 100 × 2.1 mm, 2.6 um (Phe- nomenex, Torrance, CA, USA)를 사용하였으며 retention time은 2.83, flow rate는 0.3 mL/min로 하였다.
결과 및 고찰
큰느타리 수확 후 배지 물 추출물의 토마토 풋마름병 억제 효과
큰느타리 WESMS 처리에 따른 토마토 풋마름병 억제효 과를 조사하였다. Fig. 1은 그 결과로 물처리구에서는 접종 7일 후부터 발병 정도가 1.0으로 병징이 나타나기 시작하여 13일 후에는 3.0, 15일 후에는 4.0으로 토마토 식물체가 완 전히 고사하였다. 그러나 큰느타리 WESMS 처리구는 토마 토 풋마름병균 접종 후 13일까지 발병 정도가 1.0 이하로 토 마토 풋마름병 억제효과가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 1A). Fig. 1B는 병원균 접종 후 15일 후에 큰느타리 WESMS 처 리구와 물처리구를 비교한 사진으로 WESMS 처리구에서 토마토 풋마름병 억제효과를 관찰할 수 있다. 한편, 양성 대조구로 이용되었던 병 저항성 유도 물질로 알려진 BABA 처리구는 병원균 접종 후 10일까지 큰느타리 WESMS 처리 구와 유사한 병 억제효과가 나타났으나 13일 후에는 병이 진전되기 시작하여 15일 후에는 발병 정도 3.0 이상의 토마 토 풋마름병이 발생하였다. BABA는 직접적으로 항균활성 없이 다양한 토마토를 가해하는 세균, 진균식물병원균에 대하여 식물체의 저항성을 유도하여 병 방어를 하는 것으 로 알려져 있다[13]. 노루궁뎅이 WESMS가 토마토 풋마름병 억제효과가 보고된 바 있으며 항균 효과와 병 저항성 유 전자 발현을 유도하는 복합기능성이 있는 것으로 나타났다 [9]. 표고버섯 균사체 배양액이 Pseudomonas syringae pv. glycinea, P. s y r ing a e pv. tabaci, Xanthomonas campestris pv. glycines, Erwinia amylovora, Curtobacterium flaccumfa- ciens pv. flaccumfaciens 등의 식물병원세균의 성장 억제효 과가 있으며 토마토 세균성 시들음병 방제에 효과적인 것으로 보고되었다[14, 15]. 본 연구의 큰느타리 WESMS는 토마토 풋마름병에 대하여 항균활성이 없어 항균활성에 의 한 직접적인 병 억제를 하기보다는 토마토 식물체에 병 저 항성 증대를 통한 병 억제효과 등 이외에 다른 요소가 있는 것으로 추정할 수 있었다.
Fig. 1
Suppressive effects against of bacterial wilt disease on tomato plants treated with water extract from spent mushroom substrate (WESMS) of Pleurotus eryngii. Tomato plants was treated with WESMS, DL-3-aminobutylic acid (BABA, 0.5%) and water and inoculated by Ralstonia solanacearum cells (5 × 106 cfu/mL). The disease severity was observed from 0 to 15 days after inoculation (A). The tomato was totally wilted after 15 days (B). Each point represents the mean disease index (± SE) for three independent experiments, each containing 10 plants per treatment. Disease index: 1, 10~20% wilted plant; 2, 20~50% wilted plant; 3, 50~70% wilted plant; 4, 70~100% wilted plant.
오이에 발생되는 곰팡이병인 탄저병과 흰가루병, 그리고 Pseudomonas syrigae pv. lachrimans에 의한 세균성 반점병 에 대하여 큰느타리와 잿빛만가닥버섯(Lyophyllum decaste) SMS의 고압 열수추출물의 병 방제효과를 연구된 바 있다 [16]. 이 고압 열수추출물은 식물병원균에 항균활성이 나타 나지 않았으나 오이 식물체에 처리하였을 경우 억제효과가 있어 항균활성에 의한 직접적인 효과보다는 식물체의 병 저항성 유도기구인 systemic acquired resistance (SAR) 반 응 유도에 기인하는 것으로 보고하였다. 큰느타리버섯 수 확 후 배지의 성분분석이 수행된 바 있는데 대체적으로 종 균 접종 전 배지와 비교하여 단백질함량이 낮고 cellulose 함량이 낮으며, 회분(Ash)은 5% 정도 증가하고 버섯 수확 후에 당 함량이 30~62% 소모되는 것으로 보고되었다[17]. 수확 후 배지는 영양, 생식과정을 거치며 다양한 대사 산물 이 생산될 것으로 추측되며 또한 배지에 잔존하는 균사체 로부터의 세포벽 추출물이 병 억제에 유효 기능을 할 수 있 어 큰느타리 SMS 열수추출물 중에 어떠한 성분이 토마토 식물체의 저항성을 증대시키는 저항성 유도체(elicitor) 기 능으로 작용하는지 향후 연구가 필요하다.
버섯 수확 후 배지 열수추출물(WESMS) 처리에 따른 토 마토 페놀 성분 함량 변화
식물의 병 저항성 반응의 생화학적 변화는 salicylic acid 등 신호물질 증가와 phytoalexin생합성물질 증가이며 이들은 페놀 성분으로 구성되어 있으며 페놀 성분증가는 저항 성 유도와 관련이 있는 것으로 보고되었다[18]. 따라서, WESMS 처리에 따른 토마토의 페놀 함량 변화를 조사하였 다. 노루궁뎅이 WESMS 처리구는 페놀함량이 35.28 mg/g 로 물 처리구 30.96 mg/g보다 13%의 페놀 함량이 증가하 였으며 표고 WESMS 처리구는 43.56 mg/g의 페놀 성분이 검출되어 물 처리구보다 30% 이상 증가되었다(Fig. 2). 식 물의 병 저항성 유도체로 널리 알려져 있는 BABA 처리구 는 33.12 mg/g의 페놀 함량이 나타났다. 큰느타리 WESMS 처리구는 31.68 mg/g으로 다른 WESMS 처리구에 비하여 낮은 페놀함량이 검출되었다.
Fig. 2
Content of phenolic compound on tomato plant leaves treated with water extract (WESMS) from spent mushroom sub- strate. PE, HE and LE represent Pleurotus eryngii, Hericium erinaceus and Lentinula edodes. The WEMS indicates mushroom substrate, which was not inoculated with mushroom spawn. Water and DL-3-aminobutylic acid (BABA, 0.5%) was used as negative and positive controls.
식물체의 페놀 성분(phenolic compound)은 병원균과 기 주 식물체 간의 상호작용에서 병 저항성에 중요한 역할을 한다. 페놀 성분은 병원균에 독성이 있으며 식물체 감염 후 축적된 페놀 성분은 병 저항성 유도에 관여하는 것으로 알 려져 있으며 hydroxylbenzoic acid, coumaric acid, caffeic acid는 식물체 내에서 병원균의 포자 발아와 균사생장을 억 제 또는 세포벽 분해 효소를 불활성화시킨다[18]. 특히, 병 저항성 유전자 산물인 peroxidase와 polyphenol oxidase는 lignin과 phenylalanine ammonia-lyase (PAL)이며 이들은 병 저항성 산물인 phytoalexin과 페놀 성분의 생합성에 포 함된다.
큰느타리 WESMS 처리에 따른 salicylic acid 함량 변화
큰느타리 WESMS는 항균활성이 없었지만 토마토 풋마 름병 억제효과가 관찰되었다. 이는 큰느타리 WESMS로 병 저항성 SAR 신호전달 물질인 salicylic acid (SA) 축적에 따른 저항성 유도 발현을 추정할 수 있었다. 따라서 버섯 WESMS 처리에 따른 토마토 잎의 SA 함량 여부를 조사하였다. 표준물질은 salicylic acid (Sigma-Aldrich)을 사용하 였다. 표준 salicylic acid의 calibration curve는 10~50 ng/ mL에서 correlation coefficient 값을 확인한 결과, 농도에 따라 좋은 직선성(R2 > 0.9999)을 보여 함량 측정 정확도를 확인하였다(Fig. 3).
버섯 수확 후 배지 WESMS 처리에 따른 토마토 잎의 SA 축적 여부를 조사하기 위하여 큰느타리, 노루궁뎅이, 표고 버섯 WESMS를 토마토 잎과 뿌리에 처리하고 96시간 경과 후 토마토잎의 SA 함량을 분석한 결과 큰느타리 WEMS 처 리구 3.9 ng/mL와 물 처리구 3.6 ng/mL에 비하여 큰느타리 WESMS 처리구에서 15.6 ng/mL으로 SA함량이 4배 이상 검출되었다(Table 1). 다른 노루궁뎅이와 표고버섯 WESMS 처리 토마토 잎 시료는 SA 함량이 5.2 ng/mL, 9.8 ng/mL와 비교해 큰느타리 WESMS 처리구는 2.5배에서 1.5배 SA 함량이 증가되었다
Table 1. Content of salicylic acid on tomatoes treated with
water extract from spent mushroom substrate (WESMS)
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| a)The WEMS indicates mushroom substrate, which was not inoculated with mushroom spawn. |
식물-식물병원균 상호작용 연구에서 병원균 균사체 세포 벽의 oligosaccharide 등 당 성분이 유도체로 작용하여 병 방어를 유도하는 것으로 알려지고 있다[19, 20]. 식물병 유도 저항은 전신 획득 저항(systemic acquired resistance, SAR) 과 induced systemic resistance (ISR)이 있으며 SAR은 SA 의존적으로 PR-1a를 포함하는 pathogenesis-related (PR) 유전자의 발현을 유도한다[18]. ISR은 SA 대신해서 jasm- onic acid (JA)와 ethylene (ET) 의존적인 신호전달체계로 plant defensin 1.2 (PDF 1.2)과 같은 다른 PR 유전자를 유 도한다. 버섯으로부터의 식물병 저항성 유도체 연구는 표 고버섯 자실체로부터 저 분자량의 단백질 성분이 elicitor로 작용하여 오이탄저병을 억제하는 것으로 보고된 바 있다 [21]. Parada 등[22]은 Lyophyllum decaste의 SMS 고압 열 수 추출물을 이용한 오이 탄저병균의 병 발생 억제효과를 보고한 바 있는데 SMS 추출물은 chitinase와 β-1,3-gluca- nase 유전자를 발현하여 오이 식물체의 저항성을 증가시킨 다고 하였다. 최근에는 노루궁뎅이버섯 수확 후 배지 열수 추출물의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 보고한 바 있으며 추출물 처리로 SAR 식물병 방어 체제에 연관된 PR-1a과 β-1,3-glucanase 유전자 발현이 증가되는 것으로 나타났다[9]. 일반적으로 식물병원진균의 저항성유도체는 균사체의 세포벽 성분에 포함되어 있는 β-glucan, peptide 성분이 방출되며 SAR 반응의 원인이 되는 것으로 알려져 있다[16]. 따라서, 버섯 수확 후 배지는 다량의 버섯균사체 가 밀집해 있으며 열수추출 과정에서 균사체 세포벽물질이 방출되어 병 저항성 유도체로 작용할 수 있을 것으로 생각된다. 특히 본 연구에서 큰느타리 SMS는 다른 버섯SMS보 다 강력한 토마토 풋마름병 저항성 유도를 촉진하는 것으 로 나타나 향후 병 저항성 유도체 성분의 정제 및 구조분석 에 의한 기초자료가 확보되면 보다 체계화된 식물병원균의 방제제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
큰느타리 WESMS의 식물생장촉진 효과
큰느타리 수확 후 배지 열수추출액(WESMS)을 토마토 유묘에 관주 처리하고 20일 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수와 생체량을 측정하여 생육 촉진 효과를 조사하였다. Table 2 는 그 결과로써 큰느타리 WESMS 처리 토마토 유묘는 초 장이 31.25 cm로서 물 처리 유묘 17.30 cm에 비하여 47% 이상의 초장이 증가되었다. 큰느타리 WEMS처리구와 비교 하여도 초장이 22% 이상 증가되었다. WESMS 처리구는 물과 WEMS처리구에 비하여 엽장과 엽폭의 경우는 15~ 25%, 잎수는 30~40%가 증가하였다. 큰느타리 WESMS 처 리구는 물 처리구보다 토마토 생체량이 85% 이상 증가되 었으며 뿌리생체량도 70% 이상 증가되었다. Fig. 4는 큰느 타리 WESMS 처리구와 물 처리구의 토마토생육상태를 비교한 사진으로 큰느타리 WESMS에서 뚜렷한 생육 촉진 효 과를 관찰할 수 있다.
Pleurotus pulmonarius SMS를 이용한 나이지리아의 4종 의 야채의 성장 촉진 효과 보고에 따르면 SMS처리구는 비 처리구에 비하여 식물체의 초장이 2배 이상의 성장을 촉진 시켰으며 잎수의 경우도 2배이상 증가되어 야채 식물의 수 확량이 현저히 증가되었다고[23] 하여 본 연구결과와 유사 하였다.
SMS는 버섯이 생산하는 강력한 목질 분해 효소활성으로 배지가 당화되고 균사체가 다양한 다당체를 생산하며 단백 질, 회분, 질소, 인 양이 증가하고 지방, 섬유소, 리그닌, 셀 롤로스가 감소함으로써 식물 생장촉진에 유용한 유기질 성 분을 많이 포함하고 있다[7]. 이러한 유용한 성분은 식물체 의 생육을 촉진하고 결국 식물체를 건강하게 함으로써 병 저항성이 증가되는 효과가 있을 것으로 생각된다. 결론적 으로 본 연구의 큰느타리 SMS의 토마토 풋마름병 억제효 과는 병저항성 유도, 식물 생장촉진의 복합기능성에 기인 되는 것으로 생각된다. 버섯 수확 후 배지는 버섯 대사과정 에서 생산되는 다양한 생리 활성 물질과 버섯균사체를 포 함하고 있으며 향후 토마토 풋마름병 억제인자를 탐색 발 굴한다면 큰느타리버섯 수확 후 배지는 고부가가치 기능성 물질 생산을 위한 유용한 재료로 이용될 수 있을 것으로 기 대된다.
적요
큰느타리버섯(Pleurotus eryngii) 수확 후 배지(spent mu- shroom substrate, SMS)의 물 추출액(WESMS)을 처리한 토마토 식물체는 토마토 풋마름병을 70% 이상 억제하였으 며 페놀 성분(3%)과 salicylic acid 함량이 증가되었다. 또한 큰느타리 WESMS 처리 토마토는, 초장, 엽폭, 입장, 입수, 줄기와 뿌리 생체량 등에서 물 처리 및 큰느타리버섯 배지 만을 사용한 대조군에 비하여 높은 생육 촉진 효과를 보였 다. 이는 큰느타리 WESMS가 병 저항성유도와 생육촉진의 토마토 복합기능성으로 환경친화적 풋마름병 방제에 유용 하게 활용될 수 있음을 나타낸다.
