Characterization of Wild Yeasts Isolated from Leaves Obtained from Mt. Daedun and Mt. Chilgap, Korea

한 상민  Sang-Min Han1이 상엽  Sang-Yeop Lee1김 하근  Ha-Kun Kim1이 종수  Jong-Soo Lee1

Abstract

Several yeast strains were isolated from leaves collected from Mt. Daedun and Mt. Chilgap in Korea. A total of 79 strains of 32 species were isolated from 44 leaves obtained from Mt. Daedun. Cryptococcus spp., including Cryptococcus magnus, were found to be dominant, while 16 strains of Aureobasidium pullulans were isolated. Among the strains isolated from Mt. Daedun, Asterotremella humicola JSL502, Barnettozyma californica JSL503, Bullera unica JSL501, Bulleromyces albus JSL505, and Candida vaccinii JSL507 are considered rare yeast species in Korea. All of these rare strains, except for Bulleromyces albus JSL505, formed ascospores. Bullera unica JSL501 was able to grow in yeast extract-peptone-dextrose (YPD) medium containing 10% NaCl. Twenty-five yeast strains of 18 species were isolated from 43 leaves obtained from Mt. Chilgap. Six strains of Pseudozyma spp., including three strains of Pseudozyma aphidis, were isolated in the dormant state. Of these strains, the occurrence of Rhodotorula phylloplana JSL515, Rhodotorula pinicola JSL516, Schwanniomyces vanrijiae JSL517, and Sporisorium loudetiae JSL518 is rare in Korea. Only Sporisorium loudetiae JSL518 formed ascospores, while Rhodotorula pinicola JSL516 and Sporisorium loudetiae JSL518 formed pseudomycelia. The halophilic yeast Schwanniomyces vanrijiae JSL517 was isolated and observed to grow in YPD medium containing 5% NaCl.

Keyword



서  론

효모는 자낭포자 또는 담자포자를 생성하는 유성세대와 출아법 등으로 영양생식만 유지하는 무성세대를 갖는 진균류의 일종으로 오래 전부터 전통 주류와 장류 제조 등에 주로 이용되어왔다[1].

지금까지 효모는 주로 발효식품과 이들의 원료 등에서 분리, 동정되어 보고되었으나[1,2] 최근 필자 등이 우리나라 자연 환경의 효모 종 다양성을 확립하기 위하여 우리나라 주요 산과 섬, 논밭과 과수원, 수목원, 하천 등지의 다양한 야생화들로부터 야생효모들을 분리, 동정하였다[3-10]. 또한 각종 산림 토양[11,12]이나 담수 주변 토양[13]으로부터 야생 효모들을 분리, 동정 하였고 이들 중 국내 미기록 효모들을 선별하여 미생물학적 특성 등을 조사하여 보고하였다.

이들 야생효모 중 약 38%가 Cryptococcus속 균들이었고 Candida속 균들도 많이 분리 되었으며 지역간, 야생화 종류간의 효모 종 다양성이 있음을 보고하였다.

본 연구에서는 국내 나뭇잎들의 효모 종 다양성 조사 연구의 일환으로 먼저 충청남도 남부와 전라북도 북부에 걸쳐있는 대둔산과 충청남도 청양군에 있는 칠갑산의 나뭇잎들로부터 야생효모들을 분리, 동정하였고 이들 중 국내 희귀 효모들을 선별하여 이들의 균학적, 배양적 특성을 조사하였다.

재료 및 방법

야생효모의 분리 및 동정

충청남도 금산군과 전라북도 완주군에 있는 대둔산 북쪽과 남쪽 지역에 서식하고 있는 소나무(Pinus densiflora), 신갈나무(Quercus mongolica), 굴참나무(Quercus variabilis), 졸참나무(Quercus serrata), 서어나무(Carpinus laxiflora) 등과 충청남도 청양군 대치면 대치리에 있는 칠갑산에 서식하고 있는 소나무, 편백(Chamaecyparis obtusa), 자작나무(Betula platyphylla), 밤나무(Castanea crenata), 잣나무(Pinus koraiensis) 등의 나뭇잎들을 2016년 6월과 8월 사이에 무균적으로 채취하여 멸균 튜브에 넣고, 3 mL의 멸균수를 첨가한 후 1시간 동안 진탕하였다. 이들 현탁액 일부를 스트렙토마이신(100 µg/mL)과 앰피실린(100 µg/mL)이 들어 있는 yeast extract peptone dextrose 한천배지에 도말하고 30에서 48시간 배양한 후 형성된 효모 집락들을 분리하였다[5].

효모의 동정을 위하여 26S rDNA의 D1/D2 부위의 염기서열을 분석하여 결정하였으며 결정된 염기서열들을 NCBI의 BLAST를 사용하여 데이터베이스에 등록되어 있는 효모들과의 상동성을 비교하였고 분자생물학적 유연관계를 분석하여 동정하였다[5].

국내 희귀 효모의 균학적 특성

전보[4,6,11,14]에서 대둔산과 칠갑산 나뭇잎들로부터 분리한 야생효모들 중 당시에 국내에 보고되지 않은 희귀 효모들에 대하여 일반 미생물 실험방법 등을 이용하여 형태학적, 배양학적 특징 등을 조사하였다[10,11].

결과 및 고찰

대둔산 나뭇잎들로부터 야생효모의 분리 및 동정

대둔산에서 수집한 소나무 등의 나뭇잎들로부터 야생효모들을 분리, 동정한 결과는 Table 1과 같다. 먼저 대둔산의 북쪽 지역인 충남 금산군 진산면 대둔산 기슭의 나뭇잎 22점으로부터 모두 17종 46균주의 효모를 분리, 동정하였다. 분리 균주 중 Aureobasidium pullulans가 11균주로 가장 많았고 Cryptococcus tephrensis가 6균주, Cryptococcus magnus 5균주 순이었다. 또한 전체 분리 균주 중 Cryptococcus속 균이 18균주로 거의 40%를 차지하여 가장 많이 분리 되었다.

Table 1. Yeast isolated from leaves of Daedunsan Mountain in Korea

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Table 1. (Continued)

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대둔산의 남쪽 지역인 전라북도 완주군의 대둔산 기슭에 서식하고 있는 나뭇잎 22점에서는 Cryptococcus aureus와 Aureobasidium pullulans가 각각 5균주를 포함하여 모두15종 33균주의 야생효모가 분리되었고 대둔산 북쪽에서와 같이 Cryptococcus속 균이 15주로 가장 많았다.

이상의 결과를 종합하면 대둔산 북쪽과 남쪽 지역 나뭇잎들에서 가장 많이 분리된 야생효모는 Cryptococcus속 균이었고 종 수준에서는Aureobasidium pullulans가 16균주로 가장 많았으며 공통으로 분리된 효모들은 Cryptococcus magnus 등 7종이었다. 또한 남쪽 지역보다는 북쪽 지역에 서식하고 있는 나무들의 잎에서 야생효모 2종 13균주가 더 분리되었다.

지금까지 대둔산의 미생물 종 다양성에 대한 연구는 Cho와 Kim[15]이 대둔산 도립공원의 균류 다양성에 관한 연구에서 풀귀버섯, 주황귀버섯, 다색귀버섯, 부채버섯, 졸각버섯 등의 버섯균류들이 다양하게 분포하고 있음을 보고하였을 뿐 곰팡이와 효모 등의 다양성에 관한 연구는 실시 되지 않았다. 따라서 대둔산의 효모 종 다양성 연구 결과들은 대둔산의 생물 종 다양성 확립과 유용자원 개발 등에 귀중한 자료로 활용 될 수 있을 것으로 생각된다.

대둔산 야생효모 중 국내 희귀 효모들의 선별 및 특성

대둔산에서 분리, 동정한 야생효모 중 전보[4,6,11]에서 당시 국내 미기록 효모들이었던 Asterotremella humicola JSL502, Barnettozyma californica JSL503, Bullera unica JSL501, Bulleromyces albus JSL505, Candida vaccinii JSL507 국내 희귀 효모 종들의 phylogenetic tree는 Fig. 1과 같고 이들의 형태적 특징을 조사한 결과는 Table 2와 같다.

Table 2. Characteristics of the rare yeast species from leaves of Daedunsan Mountain in Korea

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YM, yeast extract-malt extract; YPD, yeast extract-peptone-dextrose; PD, potato-dextrose; E, ellipsoidal; O, oval; B, budding; +++, very good growth; ++ or +, good growth; -, no growth; P, pink color; C, cream color; W, white color.

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Fig. 1. Phylogenetic tree of rare yeasts isolated from Daedunsan Mountain based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MEGA7.

이들 균주들중 Bulleromyces albus JSL505만이 포자를 형성하지 않았고 Asterotremella humicola JSL502와 Barnettozyma californica JSL503들은 의균사를 형성하였다. 또한 Barnettozyma californica JSL503만이 비타민이 없는 배지에서 잘 생육하였고 Bullera unica JSL501과 Bulleromyces albus JSL505는 10% NaCl을 함유한 yeast extract-peptone- dextrose (YPD) 배지에서 생육하는 호염성 효모로서 이들로부터 내염성 효소 생산 등의 산업적 응용에 관한 추가 연구가 요구된다. 이들 국내 희귀 효모들에 대한 외국 학술지 보고로는 Cadete 등[16]은 아마존 숲 보존 지역의 썩은 목재 시료들로부터 분리한 224주의 야생효모들 중 xylitol를 생성하는 균주로 Asterotremella humicola를 선별하여 이들의 특성을 보고 하였고 Barnettozyma californica은 포도나 포도주에서 처음 분리되었으며[17], D-xylose를 발효시켰고 xylanase 생산하는 효모로도 보고되었다[18]. Bullera unica에 관한 국외 연구로 Golubev와 Nakase[19]는 Bullera unica가 균체 외로 생산하는 killer toxin의 항진균활성과 이들의 표현형 등에 대하여 보고 하였고 Nakase[20]는 1980년에서 2000년까지 아시아-태평양 연안 국가들의 엽권(phyllosphere)에 서식하고 있는 Ballistosporous 효모로 Bullera unica를 보고한 바 있다.

Moriyama 등[21]은 Bulleromyces albus가 생산하는 decaprenyl diphosphate synthase 유전자를 대장균에 형질전환시켜 Co Q10과 Co Q8을 생산하였다고 보고 하였고 Sampaio 등[22]은 포르투갈의 Arrabida 자연공원에서 분리한 Bullera albaBulleromyces albus이 분류학적으로 완전히 다른 분자생물학적 특성이 있음을 보고 하였다. Candida vaccinii에 관한 국외 연구로 Sipiczki[23]는 Syria의 Malva 꽃에서 분리한, 내염성 Starmerella syriacaCandida vaccinii와 가장 근연의 균임을 보고하였다.

칠갑산 나뭇잎들로부터 야생효모의 분리 및 동정

충남 청양군 대치면 대치리에 위치한 칠갑산 일대의 소나무, 밤나무, 잣나무 등의 나뭇잎 43점으로부터 야생효모들을 분리, 동정한 결과는 Table 3과 같다.

Table 3. Yeasts isolated from leaves of Chilgapsan Mountain in Korea

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칠갑산에서는 18종의 효모 25균주 분리하였고 이 중 Pseudozyma aphidis  3균주를 포함하는 Pseudozyma속 균들이 6균주로 가장 많았고 Debaryomyces hanseniiKuraishia capsulate, Schwanniomyces vanrijiae가 각각 2균주씩 분리 되었다.

칠갑산 야생 효모 중 국내 희귀 효모들의 특성

칠갑산 일대 나뭇잎들로부터 분리한 야생효모들 중 전보[11,14]에서 당시 국내 미기록 효모들이었던 Rhodotorula phylloplana JSL515와 Rhodotorula pinicola JSL516, Schwanniomyces vanrijiae JSL517과 Sporisorium loudetiae JSL518의 phylogenetic tree는 Fig. 2와 같고 이들의 형태적, 배양적 특성을 조사한 결과는 Table 4와 같다. 세포의 형태는 구형~타원형으로 출아에 의해 영양증식을 하였고 Sporisorium loudetiae JSL51은 자낭포자를 형성하는 유포자 효모이었으며 Sporisorium loudetiae JSL518과 Rhodotorula pinicola JSL516은 의균사를 형성하였다.

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Fig. 2. Phylogenetic tree of rare yeasts isolated from Chilgapsan Mountain based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MEGA7.

Table 4. Characteristics of the rare yeasts species from leaves of Chilgapsan Mountain in Korea

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YM, yeast extract-malt extract; YPD, yeast extract-peptone-dextrose; PD, potato-dextrose; O, oval; G, global; E, ellipsoidal; B, budding; +++, very good growth; ++ or +, good growth; -, no growth; C, cream color; P, pink color; W, white color.

균주 모두 YPD 배지와 yeast extract-malt extract 배지, potatoes dextrose 배지에서 잘 생육하였고 Schwanniomyces vanrijae JSL517과 Rhodotorula phylloplana JSL515는 비타민이 없는 배지에서도 잘 생육하였다. 특히 Rhodotorula pinicola JSL516과 Schwanniomyces vanrijiae JSL517은 5% NaCl을 함유한 YPD 배지에서도 생육하는 호염성 효모이었다. 또한 이들 희귀 효모 균주들은 20~30와 pH 4.0~7.0에서 생육하였다.

이들 효모들에 대한 외국 학술지 발표로 Janisiewicz 등[24]은 자두 표면에서 분리된 Rhodotorula phylloplana이 핵과류의 균핵병을 생물학적으로 방제하기 위한 유용 효모임을 보고 하였고 Zhou 등[25]은 등골나물(Eupatorium adenophorum)의 병이 없는 잎에서 분리한 Ustilaginomycetes 균들이 Rhodotorula phylloplana와 근연균임을 보고 하였다. 또한 Vaca 등[26]은 남극 해안 해면동물에서 저온내성 효모로서 Rhodotorula pinicola를 분리하여 이들의 균체 외 효소 생성 유무를 확인한 결과 전분과 단백질, 지질 분해 활성이 있어 이들이 산업적으로 매우 중요한 자원이 될 것으로 보고하였다. Maksimova 등[27]은 러시아 Novosibirsk 근처의 Birch-Pine Grass 숲의 Anthill material에서 우점균 효모로 본 연구의 희귀 효모인 Schwanniomyces vanrijiae를 보고하였고 Ingold[28]는 Sporisorum loudetiae- pedicellatae를 남아프리카 북부 Chippind에서 분리하여 이들의 특이적인 동포자(teliospore)의 발아에 대하여 보고하였다.

적  요

충청남도와 전라북도에 걸쳐있는 대둔산과 충청남도 청양군 칠갑산의 각종 나뭇잎 87점을 수집하여 야생효모들을 분리, 동정하였다. 대둔산 나뭇잎들에서는 Cryptococcus tephrensis JSL0131를 포함하는 Cryptococcus속 균이 18균주로 가장 많이 분리되었고 Aureobasidium pullulans도 16균주가 분리되었다. 이들 중에서 Asterotremella humicola JSL502, Barnettozyma californica JSL503, Bullera unica JSL501, Bulleromyces albus JSL505와 Candida vaccinia JSL507이 국내 희귀 효모들이었고 Bulleromyces albus JSL505와 Bullera unica JSL501은 10%의 NaCl을 함유한 배지에서도 생육하는 호염성 효모였다. 칠갑산 나뭇잎에서는 Pseudozyma aphidis JSL614를 포함하는 Pseudozyma속 균이 가장 많이 분리 되었다. Rhodotorula phylloplana JSL515, Rhodotorula pinicola JSL516과 Schwanniomyces vanrijiae JSL517과 Sporisorium loudetiae JSL518 등 4균주들이 국내 희귀 종이었고 Sporisorium loudetiae JSL518은 포자와 의균사를 형성하였으며 Rhodotorula pinicola JSL516과 Schwanniomyces vanrijiae JSL517은 5% NaCl을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 호염성 효모이었다.   

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the National Institute of Biological Resources, funded by the Ministry of Environment of the Republic of Korea.

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