서 론
양송이(Agaricus bisporus Sing.)는 우리나라의 대표적인 식용버섯으로 2012년도에는 국내 버섯 총생산량의 6.9%인 일만 삼천톤이 생산되었다[1]. 양송이는 독특한 향과 맛, 조직감뿐만 아니라 영양소를 고루 함유하고 있어 식품소재로 비교적 많이 이용되고 있다[2,3]. 양송이는 사물기생균으로써 생육에 필요한 질소·인산·칼리·칼슘 등 각종 영양분을 배지로부터 얻는다. 따라서 배지의 양호한 발효가 양송이 균사생장 및 자실체의 수량과 직접적으로 연관되고 버섯의 생산량에 결정적인 영향을 미친다. 양송이 배지의 주재료는 탄소원으로 서양에서는 주로 마분과 밀짚이 사용되었고, 쌀이 주식인 우리나라는 볏짚을 이용한 배지를 개발하여 사용하고 있다. 볏짚의 세포벽을 분해하기 위해 퇴비 발효 단계에 있어 주로 암모니아 처리로 질소 성분인 계분 및 마분을 처리하여 미생물이 보다 쉽게 볏짚을 분해하면서 퇴비화 과정을 거치게 된다. 볏짚은 벼농사의 부산물로 여러 분야에 많이 이용되는 재료로 식물세포벽의 기본 구성 성분인 cellulose, hemicellulose, lignin 등 견고한 조직으로 이루어져 있다[4]. 일반적으로 식물체에는 난소화성 탄수화물이 다량 함유되어 있는데, 그 중에서도 cellulose는 glucose가 ß-1, 4-glycosidic 결합에 의해 이루어진 고분자 물질이며, 식물체뿐만 아니라 Bacillus, Pseudomonas, Azotobactor, Enterobacter, Burkholderia, Rhizobium 등 미생물에 의해서도 생산된다고 알려져 있다[5]. 이러한 cellulose 분해 효소는 퇴비화 촉진 등 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다[6]. 또한, hemicellulase는 섬유성 바이오매스에 포함된 hemicellulose를 분해하여 cellulase에 의한 cellulose의 분해 작용을 향상시킨다[7].
양송이 재배 과정은 일반적으로 볏짚 발효, 균사 배양 및 자실체 수확의 세 단계로 구분된다. 이 중 볏짚 발효 단계는 야외발효와 후발효 단계를 거치면서 다양한 미생물의 작용으로 물리·화학적 변화가 일어나게 된다. 양송이의 균사생장과 자실체 형성에 알맞은 퇴비의 C/N율은 17 정도이며[8], 배지 퇴적시 C/N율은 15~20으로 낮아지는데 이는 주로 볏짚 내 미생물의 작용에 의해 cellulose와 hemicellulose의 감소에 의한 것이다[9]. 볏짚의 야외발효 및 후발효 과정이 고품질의 버섯 생산을 위한 가장 중요한 단계이며, 이 과정은 수분과 온도 및 산소 농도의 제어를 통해 배지의 물성을 변화시켜 유용 미생물 증가 및 유해 미생물 제거 등에 관여 한다. 또한 후발효 과정에서 증가된 유용 미생물에 의해 배지가 분해되어 안정화되는 과정으로 양송이 생장에 필요한 영양원이 되고 있다[10].
본 연구는 양송이 재배에서 볏짚 배지의 발효 단계별 관여 미생물의 분포양상 및 그 특성을 조사하여 배지발효의 안정성 확보를 통한 고품질의 양송이를 생산하기 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
재료 및 방법
양송이 배지 발효
본 실험은 양송이 재배 농가(충남 부여군 석성면)에서 직접 수행하였으며, 버섯 재배용 배지는 볏짚(7.0 톤), 계분(1.4 톤), 요소(0.1 톤)를 혼합하여 사용하였다. 주재료인 볏짚의 수분함량을 75% 내외로 조절하고 유기태 급원(요소, 계분)을 첨가하여 볏짚과 골고루 혼합하여 일정한 높이로 퇴적하여 야외발효를 실시하였다. 배지의 온도가 80°C에 도달할 때 산소의 원활한 공급과 균일한 배지발효를 유지하기 위하여 4번 뒤집기를 하였다. 야외발효 4차 뒤집기 후 볏짚의 물리성을 좋게 하기 위해 석고를 첨가하였고, 후발효를 실시하기 위하여 재배사에 균일하게 입상하였다. 입상이 끝난 후 재배사의 문과 환기구를 닫고 배지의 온도를 높이기 위하여 재배사를 가온한 뒤 배지의 온도를 60°C에서 8시간 유지한 후 55~58°C에서 4일, 45~50°C에서 2일후 발효를 완료시켰다.
실험재료 및 채취 방법
시료채취는 야외발효(1차, 2차, 3차, 4차 뒤집기)와 후발효 완료 배지에서 채취하였다. 야외발효 단계에서 시료 채취는 배지더미를 반으로 나눈 뒤 단면의 상충, 중간충, 하층에서 3곳 이상의 시료를 채취하여 골고루 섞은 후 실험에 사용하였다.
미생물의 분리
미생물의 분리는 R2A 배지[11]에 단계별로 희석 배양하여 50~60개의 colony를 형성한 plate로부터 독립적으로 분리하였다[12]. 순수 분리한 미생물은 R2A 배지에서 2일 동안 배양한 후 균체를 모아서 20%(v/v) 글리세롤을 포함하는 －70°C에 보존하면서 검정용 시료로 사용하였다.
미생물 밀도조사
양송이 복토내 미생물의 밀도는 희석평판법으로 조사하였다. 시료 10 g을 멸균수 90 mL에 첨가하여 진탕배양기에서 200 rpm으로 30분간 진탕하여 102~107 배가 되도록 희석액을 만들어 이를 미생물 수 측정에 사용하였다. 호기성 세균은 R2A agar[11], 사상균은 streptomycin- rose bengal agar[13], 중온성 방선균은 starch casein agar[14]을 사용하였고, 고온성 방선균은 1/2 nutrient agar 배지(1/2 NA, 0.2% casein, 10g agar)를 사용하였다. Trichoderma속은 THSM 배지[15]를 사용하였고, Pseudomonas속은 P-1 agar[16]를 각각 선택 배지로 사용하였다. Bacillus속 검출을 위해서는 희석액을 80°C 열수에서 10분간 처리 후 yeast glucose agar 배지[17]에 배양하였다. 폐상퇴비내 미생물 수는 각각의 선택 배지 3개의 평판 배지에 나타난 colony를 계수한 후 평균값을 콜로니 형성단위(colony forming unit, cfu)로 표시하였다. 배양은 세균과 곰팡이는 28°C 항온기에서 2~7일간 배양하면서 계수하였고, 방선균의 경우 중온성(28°C)과 고온성(45°C)으로 나누어 항온기에서 7일간 배양하면서 계수하였다.
분리 미생물의 분포조사
배지발효 단계별 분리한 미생물의 분포조사를 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다[18]. DNA는 Qiagen Genomic DNA Isolation Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 분리하였고, PCR 증폭은 Techne thermocycler (Bibby Scientific Limited, Stone, UK)로 수행하였다. PCR 반응혼합액은 1 ⅹ buffer (10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.01% gelatin and 0.1% Triton X-100), 최종농도 200 µm의 deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP), 0.6 U Taq DNA polymerase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 최종농도 2 µm의 정, 역방향의 primers [fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3')와 rP2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')] 그리고 10 ng template DNA로 이루어졌다. PCR은 94°C에서 1분, 56°C에서 1분 그리고 72°C에서 2분간 30 cycles로 수행하였고, 반응 후 primer와 dNTP는 High Pure PCR Product Purification Kit (Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 PCR 산물로부터 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pT7 blue Vector (Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에 클로닝하여 Big Dye Terminator Kit와 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. 종 유사성 결정을 위해 Clustal W 분석프로그램[19]을 사용하여 GenBank에 있는 다른 염기서열들과 비교하였다.
분리 미생물의 효소활성 검정
양송이 배지 제조 과정 중 볏짚 내 미생물의 효소 생산용 배지는 minimum salt (MS) 배지(0.5% yeast extract, 0.5% poly peptone, 0.5% NaCl, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.1% K2HPO4)를 기본 배지로 사용하였으며, cellulase와 polygalacturonase 활성은 기본 배지에 1.0% carboxymethyl cellulose (CMC, pH 7.0)와 polygalacturonic acid (pH 5.0)를 첨가한 액체 및 고체 배지를 사용하였다. 그리고 hemicellulase는 기본 배지에 0.5% xylan을 첨가하였고, protease는 20% 탈지분유 용액을 최종농도 1.0% 또는, 0.5% skin milk을 첨가하여 사용하였다. 균의 배양은 10~70°C, pH는 3.0~9.0에서 150 rpm으로 36시간 동안 진탕배양 하였고 균주의 생육 정도는 UV spectrophotometer를 이용하여 600 nm의 흡광도로 측정하였다.
결과 및 고찰
발효 단계별 배지 내 미생물상 변화
양송이 재배농가에서는 배지발효 문제로 재배에 실패하는 경우가 많이 발생하고 있으며, 이들 배지발효와 밀접한 관련이 있는 미생물들 분포양상을 조사하였다. 배지 재료인 볏짚과 계분에는 호기성 세균, 방선균, 유해균이 포함된 다양한 미생물들이 분포하고 있었다(Table 1). 그리고 야외발효 단계별 배지 내에는 고온성 세균(Bacillus spp.), 방선균, 형광성 Pseudomonas속, 사상균 등 다양한 미생물들이 분포하였고, 특히 배지발효 과정에서 배지의 분해와 발열에 호기성 세균의 분포는 1차 뒤집기에서 가장 높은 밀도를 보였고, 발효가 진행되면서 밀도는 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 고온성 발효과정 중 푸른곰팡이균(Trichoderma)과 중온성 방선균은 생육이 억제되거나 사멸되는 양상을 보였고, cellulose, lignin, chitin 등을 분해하는데 중요한 역할을 하고 있는 고온성 방선균은 높은 밀도를 보였다. 야외발효 과정중 배지내의 산소공급이 원활하지 않아 퇴적배지의 하층부분에는 혐기성 발효가 일어나게 된다. 따라서 뒤집기를 통해 혐기성 발효를 최소화하고 배지가 잘 혼합되어 균일하게 발효가 일어날 수 있도록 하였다. Table 3에서는 호기성 발효와 혐기성 발효 부위에서의 미생물 분포 양상을 나타내었다. 호기성 세균은 혐기성 발효 보다 호기성 발효 부위에서 높은 밀도를 보였지만 고온성 세균은 혐기성 발효 부위에서 오히려 높은 밀도를 보였다. 고온성 방선균의 경우 1차 뒤집기 시료를 제외한 모든 단계에서 호기성 발효 부위에서 높은 밀도를 보였고, 형광성 Pseudomonas속, 푸른곰팡이균, 일반 곰팡이균, 중온성 방선균 등은 검출되지 않았다. 따라서 야외발효 과정중에는 푸른곰팡이균을 비롯한 일반 곰팡이류는 검출 되지 않아야 하고, 고온성 방선균은 다량 검출되어야 양송이 배지에 적합한 정상적인 발효가 이루어진 것으로 판단할 수 있다. Baker 등[20]은 호기적인 퇴비화 과정에서 세균, 방선균 등의 미생물이 큰 역할을 하며 초기에는 중온성 세균이 우점을 하고 곧바로 온도가 상승함에 따라 고온성 세균, 방선균의 밀도가 증가한다고 하였다. 또한, Shin[21]은 퇴비온도가 20°C일때 Pseudomonas속, Sarratia속 등 세균이 우점하였고, Penicllium 등 사상균은 생육하지만, 방선균은 확인 할 수 없었으며, 퇴비온도가 35~45°C에서는 Bacillus, Pseudomonas등 세균이 왕성하게 생육하였고, Mortierella, Aspergillus 등 사상균 및 고온성 방선균이 나타났으며, 55°C에서는 Bacillus, Pseudomonas 등의 세균과 방선균의 활동이 왕성하였다고 보고하였는데, 본 연구에서도 야외 및 후발효 과정에서 Bacillus속과 Pseudomonas속이 가장 많이 분포하였다.
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Table 1. Density of microbial population on each material for button mushroom compost |
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cfu, colony forming unit; ND, not determined. |
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Table 2. Change of microbial population density on each composts during stages of outdoor composting process |
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cfu, colony forming unit; ND, not determined. |
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Table 3. Change of microbial population density on the aerobic and anaerobic zone during outdoor composting process |
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cfu, colony forming unit; ND, not determined. |
발효 과정 중 분리 미생물의 분포
양송이 발효 과정 중 배지내 우점하는 미생물의 분포를 조사하기 위하여 16S rDNA 분석법을 이용하여 동정하였다. 배지 재료에서 분리한 미생물을 동정한 결과 볏짚에서는 Staphylococcus속이 58.5%, Microbacterium속이 12.2%로 가장 우점하였고(Fig. 1a), 그 외 Pseudomonas속 등 8종이 분포하고 있었다. 수분을 첨가한 볏짚의 경우 Pseudomonas속이 28.8%, Stenotrophomonas속이 27.3%로 가장 우점하였으며(Fig. 1b), 계분에서는 Bacillus속만 분포하는 단순한 양상을 보였다(Fig. 1c). 야외발효 및 후발효 과정에서 분리한 미생물의 분포를 조사한 결과 1차 뒤집기한 시료에서는 Psychrobacter속 42.4%, Pseudomonas속 30.5%, Bacillus속 23.7%로 가장 많은 분포하고 있었으며(Fig. 2a), 2차 뒤집기에서 Bacillus속이 가장 우점 하였고 그 분포율은 84.6%였고, 그 다음 Pseudomonas속이 9.6%로 가장 많이 분포하는 것을 확인하였다(Fig. 2b). 3차 뒤집기에서는 Psychrobacter속 44.0%, Bacillus속 34.0%로 가장 많이 분포하고 있었으며(Fig. 2c), 4차 뒤집기에서는 Pseudoxanthomonas속 23.4%, Sphingobacterium속 10.6%로 가장 우점 하였고, 야외 발효가 진행될수록 4차 뒤집기에서 미생물의 분포가 다양해지는 양상을 보였다(Fig. 2d). 그리고 후발효 완료에서는 Bacillus속이 76.1%로 가장 많이 분포하는 것을 확인하였다(Fig. 2e). 분리 균주 중 우점균으로 확인된 Bacillus속과 Pseudomonas속은 식물의 성장을 조절하는 인산가용화, 질소고정, 식물 성장촉진 호르몬(auxin, cytokinin, gibberelin)의 생산, 에틸렌 조절 등의 기작이 알려져 있다[22]. 또한, Bacillus속은 항생물질에 의해 식물병원균의 생육을 저해하는 항생작용[12] 및 생육공간에서 영양분과 같은 생육에 필요한 인자를 경쟁함으로써 병원균의 생육 및 증식을 억제하는 길항작용으로 많이 알려져 있다[23].
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Fig. 1. Identification of several bacteria isolated from button mushroom compost on the basis of 16S rDNA analysis. (a) rice straw; (b) watering straw; (c) chicken manure. |
양송이 배지 발효 중 미생물의 효소활성 변화
양송이 배지에서 분리한 미생물의 세포벽 분해 효소활성은 각각의 선택 배지에서 분해환(clear zone)의 크기로 조사하였다(Figs. 3, 4). 야외발효 1차 뒤집기에서 분리한 미생물의 cellulose, hemicellulose 분해효소는 약한 활성을 보였고, pectin 분해효소는 강한 활성을 보였다. 그러나 protease 분해효소는 활성을 거의 보이지 않았다. 2차 뒤집기에서 분리한 미생물은 cellulose, hemicellulose에 대해서는 강한 활성을 보였으며, 특히 proteose 분해효소를 가진 미생물의 분포가 가장 많았다. 또한 2차 뒤집기 및 3차 뒤집기에서 분리한 미생물은 1차 뒤집기에 분리한 미생물보다 효소활성이 높은 미생물의 분포가 높았다. 전체적으로 분리 미생물의 효소활성은 발효 초기에 cellulose 분해효소가 먼저 배지에 작용하여 탄소원을 분해한 후 hemicellulose 분해효소가 부차적으로 작용하는 양상을 보였고, 이들 효소를 분비하는 미생물들은 2차와 3차 뒤집기에서 많이 분포하는 것을 알 수 있었다. 그리고 pectin 분해효소는 전체 발효 과정 동안 왕성하게 작용하였으며, 특히 2차 뒤집기에서 분리한 미생물이 가장 강한 활성을 보였으며, protease 분해효소는 발효 초기에 왕성하게 작용하지만, 발효 후기로 갈수록 작용 양상은 줄어들었다(Fig. 4). Shin[21]은 볏짚이 발효될 때 cellulose, hemicellulose는 미생물에 의하여 간단한 당류로 분해되고 퇴비의 온도는 상승하게 된다고 하였다. 또한, cellulose를 분해하는 세균으로 Bacillus속, Pseudomonas속, Clostridium속, Cellulomonas속 등이 많이 알려져 있다[6].
적 요
본 연구는 양송이 배지의 관행적인 발효기술 개선에 대한 기초자료를 제공하기 위하여 배지 발효에 중요한 역할을 하는 다양한 미생물에 대한 밀도변화 및 분류학적인 특징을 밝혔고, 이들 미생물이 분비하는 세포벽 분해 관련 효소활성 변화를 조사하였다. 양송이 배지 발효와 밀접한 관련이 있는 미생물의 밀도 변화를 분석한 결과 고온성 세균, 방선균, 형광성 Pseudomonas spp., 사상균 등 다양한 미생물들이 분포하였으며, 고온성 발효가 진행됨에 유해균은 사멸되는 경향을 보였다. 야외발효 과정에서는 Psychrobacter속, Pseudomonas속, Bacillus속, Pseudoxanthomonas속이 가장 많이 분포하였고, 후발효 완료 배지에서는 Bacillus속, PsychroBacillus속이 우점하였다. 이러한 볏짚 발효 과정 중 분리한 미생물의 효소활성은 발효 초기에 cellulose 분해효소가 먼저 배지에 작용하여 탄소원을 분해한 후 hemicellulose 분해효소가 부차적으로 작용하는 양상을 보였고, 이들 효소를 분비하는 미생물들은 2차와 3차 뒤집기에서 많이 분포하였다.
