First Report of Diaporthe tectonae Isolated from Soil in Korea

Diaporthe속(Diaporthaceae, Diaporthales)은 주로 목본계 식물에서 발견되는 진균류로서, 많은 종류의 식물병원균 및 내생균을 포함하고 있다. 특히, 이 균은 다양한 기주식물에  가지 및 줄기마름병, 점무늬병이나 뿌리썩음병 등을 일으키는 것으로 알려져 있는  중요한 분류군이다[1]. 또한 Diaporthe속의 진균류는 다양한 식물에서 내생균으로 발견되기도 하는데 느릅나무나 소나무, 티크, 눈측백 등과 같이 다양한 목본류 식물로부터 분리된 보고가 있다[2-5]. 이렇게 내생균으로서 존재하는 Diaporthe속의 진균류는 항균효과나 항암효과를 가지는 효소 또는 2차 대사산물을 생성하여 숙주식물에 유해한 생물 및 무생물적 요인에 대한 저항성을 제공하기도 한다[6,7]. Diaporthe속은 Nitschke에 의해 최초로 명명된 이후 지금까지 880여 종의 균류가 보고되었으며, Phomopsis속의 유성세대명으로 잘 알려져 있다[8]. 이전까지 Diaporthe 또는 Phomopsis에 속하는 균류의 분류 및 명명은 균학적 특징과 발견된 기주식물의 종류에 따라 이루어지는 것이 일반적이었으나 최근의 연구는 Diaporthe속의 단일 종이 여러 종류의 기주로부터 발견되거나 또는 하나의 기주가 Diaporthe속의 여러 종에 의해 감염되어 있는 사례가 보고되고 있다[9-11]. 따라서 Diaporthe속에 속하는 진균류의 분류학적 재 고찰의 필요성이 제기되고 있으며, 균학적 형태 분석과 더불어 분자생물학 기법을 활용한 계통학적 유연관계 분석이 활발하게 진행되고 있다[12]. 분자생물학적 계통분석이 이루어짐에 따라 유성세대 Diaporthe속과 무성세대 Phomopsis속 간의 상관관계에 대한 분석이 이루어지고 있으며. 이러한 계통학적 유연관계 분석에는 진균류의 분석에 주로 사용되는 유전자인 internal transcribed spacer (ITS) 영역과 함께 β-tubulin (BT), translation elongation factor 1-α (EF1-α), actin (ACT), calmodulin (CAL) 등 다양한 유전자를 활용하는 다자위 염기서열 분석 (multi-locus sequence analysis)이 주로 사용되고 있다[8]. 본 연구에서는 국내의 토양에 존재하는 균류의 다양성을 조사하는 과정에서 국내에 아직 보고되지 않은 Diaporthe tectonae를 분리하여 그 형태 및 계통학적 특성을 보고하고자 한다.

토양에 서식하는 균류를 분리하기 위해, 전북 전주시 완산구에서 토양시료를 채집하여 멸균된 conical tube에 넣고 밀봉하여 실험실로 운반하였다. 채집한 토양 1 g을 멸균수 10 mL에 넣고, 진탕배양기에서 30분간 150 rpm으로 진탕하여 미생물이 충분히 이탈하도록 하였다. 토양 현탁액을 멸균수에 10배씩 순차적으로 희석하여 희석액을 제작하고, 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA)에 100 µL 도말하여, 25°C에서 암배양하였다. 배양 3일 후 자라난 직경 1 mm가량의 균총을 새로운 PDA에 치상하고 25°C에서 암배양하여 순수한 균주를 확보하였다. 분리된 균은 7일간 배양하였을 때 직경 80 mm의 크기로 생장하였으며, 기중균사는 5 mm 이상으로 백색의 양털 모양을 가지고 있었다. 균총의 표면은 백색이었다가 시간이 지남에 따라 갈색으로 변하였으며 중심으로부터 기중균사가 파도와 같은 모양을 그리며 풍성하게 생장하였다(Fig. 1A). 균총의 배면은 배양 초기 백색이었으나 3일 후부터 갈색을 띠기 시작하여 20일 후에는 전체적으로 옅은 갈색에서 짙은 갈색까지 불규칙한 무늬를 가지는 모양을 나타내었다(Fig. 1B). 배양 40일 후부터 균총의 표면에 검은 색의 울퉁불퉁하고 단단한 표면을 가진 구형의 분생자과(conidiomata)가 형성되기 시작하였으며 크기는 약 0.8~1.2 mm 정도였다(Fig. 1C). 분리한 균의 형태적 특징을 알아보기 위해 형성된 분생자과를 채취하여 1% 메틸렌 블루 용액으로 염색한 후 광학 현미경(BX50; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 분생자경(phialide)과 포자를 관찰하였다. 관찰 결과, 분생자경은 길이 14~23 µm, 폭 1~2 µm의 크기에 끝부분으로 갈수록 가늘어지는 원통형의 다발로 형성되었고, 끝부분에 분생포자 형성세포(conidiogenous cells)가 생성되었다(Fig. 1D, 1E). 분생포자는 단생으로 격막은 존재하지 않았으며, 내부에 2개의 물방울 모양의 무늬를 가진 타원형 또는 원통형이었고, 길이는 4~7 µm, 폭은 2~3 µm였다(Fig. 1F). 이러한 형태적 특징은 이전에 보고된 D. tectonae의 형태와 일치한다 (Table 1)[13].

분리한 균을 분자생물학적으로 동정하기 위해 균총의 일부를 채취하여 HiGene Genomic DNA prep kit (BIOFACT, Daejeon, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA 시료를 주형으로 하여 진균 특이적인 프라이머 조합인 ITS1F/ITS4[14], Bt2a/Bt2b [15], EF1-728F/EF1-986R[16]를 사용하여 각각 internal transcribed spacer (ITS) 영역, β-tubulin (BT), translation elongation factor 1-α (EF1-α) 유전자를 증폭하였다. 유전자의 증폭을 위해 수행한 PCR의 조건은 95°C에서 2분간 pre-denaturation을 진행하고, 95°C에서 30초간의 denaturation, 유전자마다 정해진 온도에서 30초간 annealing, 그리고 72°C에서 1분간 extension을 1 cycle로 하여 총 35회 반응을 진행하였다. 마지막으로 72°C에서 5분간 final extension을 진행하여 반응물을 안정화하였다. Annealing 온도는 ITS영역 55°C, β-tubulin 58°C, EF1-α는 52°C에서 각각 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 0.7% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 뒤 UV illuminator를 이용하여 목적한 유전자의 증폭 여부를 확인하였다. 증폭이 확인된 PCR 산물은 EXoSAP-IT을 이용하여 정제하였으며 이후 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석한 염기서열들을 NCBI GenBank database에 등록하였으며(Accession no. LC215944, LC215945, LC215946) BLAST 검색을 통하여 GenBank의 database와 비교하여 다른 종들과의 유사도를 확인하였다. 분석 결과, 본 연구에서 분석된 염기서열들은 ITS, β-tubulin, EF1-α 세 유전자 모두 D. tectonae MFLUCC- 14-1139와 99%의 유사도를 가지는 것으로 나타났다. 계통학적 유연관계를 분석하기 위해 NCBI의 GenBank에 등록된 여러 근연종의 염기서열 자료를 수집하였다(Table 2). 수집한 여러 근연종의 염기서열들을 MEGA6 프로그램을 사용하여 각 유전자별로 정렬한 뒤 정렬한 염기서열들을 ITS, β-tubulin, EF1-α의 순서로 연결하여 결합염기서열을 작성하고, neighbor-joining 알고리즘을 통해 계통수를 작성하였다[17]. 계통분석을 위한 외집단(outgroup) 으로는 Diaporthella corylina를 사용하였다. 분석 결과 토양에서 분리한 균주는 국외에서 보고된 D. tectonae와 같은 그룹을 형성하였으며, Diaporthe속의 다른 근연종과 명확히 구분되는 것을 확인하였다(Fig. 2). 따라서, 형태학적 특징과 계통학적 유연관계의 분석 결과를 종합하여 판단할 때, 본 연구를 통해 토양에서 분리된 균주는 D. tectonae인 것으로 확인되었다. 본 연구에서 확보한 D. tectonae 균주는 국립생물자원관(National Institute of Biological Resources, http://www.nibr.go.kr)에 기탁하여 향후 추가적인 연구에 활용할 수 있도록 하였다(표본번호 KZITFG0000000591).

D. tectonae는 2016년 태국 북부의 티크(Tectona grandis)에서 발생한 줄기마름 병반으로부터 분리된 것이 최초 보고이다[13]. D. tectonae는 Diaporthe에 속한 진균류 중에서는 최근에 보고된 종으로서, 아직까지 생태나 특징에 대해서는 밝혀진 바가 매우 미미하다. 계통학적으로 D. tectonae는 카카오나무(Therbroma cacao)의 새싹마름 병반으로부터 분리된 D. tulliensis와 가장 가까운 것으로 나타나고 있으나, 균학적 특징에서 분생포자의 모양이 D. tectonae가 좀더 짧고 굵은 모양을 띠고 있다.  D. tectonae의 균총의 색이 갈색인데 비해 D. tulliensis의 균총은 회색이고, 기중균사가 적다는 특징을 갖고 있어 구분된다[18]. Diaporthe속의 진균류는 다양한 목본계 식물의 내생균으로 존재하며, 식물을 보호하는 한편, 식물병원균으로서 여러 작물에 피해를 주기 때문에 그 연구 가치가 매우 큰 진균류이다.  본 연구에서 분리한 D. tectonae는  최근에 발견된 균주로서 향후 연구 가치가 크다고 할 수 있다.

적  요

전북 전주시 완산구의 토양으로부터 국내 미기록종인 균류를 분리하였다. 형태학적 특징 및 ITS영역, β-tubulin, EF1-α 유전자를 이용한 계통학적 분석 결과, 토양에서 분리한 균류는 Diaporthe tectonae인 것으로 확인되었으며, 본 연구를 통해 D. tectonae가 국내에 존재함을 최초로 보고하였다.