서론
표고버섯은 한국, 중국, 일본 등 아시아 국가에서 일반적으로 재배되는 버섯으로[1], 2014년 전세계 버섯 생산의 약 17%를 차지하였다[2]. 2014년과 2015년 국내 표고버섯의 생산액과 생산량은 국내 임산버섯 생산의 약 97%를 차지하고 있고[3], 우리나라 국민의 버섯 선호도는 표고버섯(20.6%), 새송이버섯(13.4%), 느타리버섯(12.9%), 양송이버섯(11.1%), 팽이버섯(8.9%) 순이었다[4]. 이처럼 표고버섯은 버섯 시장, 그리고 단기소득 임산물에서 매우 중요한 위치를 차지하고 있다.
우리나라는 2002년에 국제식물신품종보호동맹(International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV)에 50번째로 정식 가입하였으며, 2008년부터는 표고버섯이 ‘종자산업법’에 의거한 품종보호 대상 작물로 지정되었다. 그리고 2010년 10월 제 10차 생물다양성협약 당사국 총회를 통해 나고야 의정서가 채택됨에 따라 각국은 현재 보유하고 있는 유전자원에 대한 보호를 강화할 것으로 생각된다.
이에 따라 표고버섯의 품종을 개발할 때 품종의 구별성은 더욱 중요해지고 있으며, 우리나라에서는 산림청에서 제작한 표고버섯 특성조사요령에 의하여 품종간 구별을 하고 있다[5]. 하지만, 형태 표지 이외에 분자마커를 이용한다면 품종 구분에 있어서 더욱 객관적이고 효율적일 것이다. 따라서 국내에서 보급되고 있는 국산 표고버섯 품종을 분자마커로 구분하는 것은 우리나라 표고버섯 유전자원을 보호하는 한편 수입 품종에 대한 구별성 확보 등에 중요하다.
표고버섯의 품종 및 야생 균주에 대한 구분, 다양성, 형질 등을 분석하기 위하여 restriction fragment length polymorphism (RFLP) [6], random amplified polymorphic DNA (RAPD) [7-9], amplified fragment length polymorphism (AFLP) [10], simple sequence repeat (SSR) [11], inter-simple sequence repeat (ISSR) [8, 12, 13], sequence-characterized amplified region (SCAR) [9, 14-16], sequence-related amplified polymorphism (SRAP) [8, 13] 등의 분자마커를 이용하였다. 이러한 분자마커는 유전 현상의 본질인 DNA를 기반으로 하기 때문에 세포의 성장과 발달, 분화 등과 관계없이 안정적인 결과를 얻어낼 수 있고, 모든 조직에서 검출이 가능하다는 장점을 가지고 있다[17]. 최근 Shim 등[18]과 Chen 등[19]에 의하여 표고버섯의 genome sequencing이 수행되어 발표됨에 따라 앞으로 표고의 형질 관련 그리고 각 품종을 구분할 수 있는 분자마커 개발이 활발히 진행될 것으로 보인다.
DNA 염기서열 상에 생길 수 있는 변이로는, 염기서열 하나의 치환인 single nucleotide polymorphism (SNP)와 염기 서열 하나 이상의 삽입 또는 결실인 insertion and deletion (Indel)이 있다. 현재까지 개발된 다양한 분자마커 중 몇몇은 품종간의 판별과 다양성 분석에 이용되어 왔는데[8, 20], 그 중 cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS)는 DNA 염기서열의 변이로 인해 생기거나 사라진 제한효소 인식부위를 탐지하여 이를 마커로써 이용하는 방법이다[21]. CAPS를 이용한 분석법은 고가의 장비를 필요로 하지 않을 뿐만 아니라, 간단한 과정을 통해 안정적이고 명확한 결과를 얻어낼 수 있다는 장점이 있다[22]. 본 연구에서는 표고버섯 품종 산마루1호와 천장3호를 구분할 수 있는 CAPS 마커를 개발하고자 하였다.
재료 및 방법
시험균주와 DNA 추출
시험에는 표고의 표준유전체 대상균주인 B17 [18]을 포함하여 산림과학원에서 육성된 균주 5종(백화향, 산백향, 천장3호, 산마루1호, 산마루2호), 산림조합에서 육성된 균주 4종(산조701호, 산조707호, 산조708호, 참아람)이 이용되었다. 균주들은 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 25°C에서 암배양 하였다.
DNA 추출은 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하여 약 2주간 암조건에서 25°C, 110 rpm 진탕배양한 균사체를 이용하였다. 배양한 균사체를 미라클로스(miracloth)에 여과시킨 후 PBS buffer (135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4 및 1.4 mM KH2PO4)로 세척하고 키친 타올로 물기를 제거하였다. 건조된 균사 100 mg을 액체질소에 얼려 막자사발로 곱게 갈은 후, 제조사의 프로토콜에 따라 GenEx Plant kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 튜브에 옮겨 담은 균사체에 PL buffer 500 µL를 넣고 65°C에서 10분간 가열해준 후 pipette을 이용해 잘 섞어주었다. 13,000 rpm으로 1분간 원심분리한 후, 분리한 상층액에 PP buffer를 상층액의 1/3만큼 넣고 볼텍서를 이용해 잘 섞어주었다. 얼음에서 5분간 방치 후 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 분리했다. 상층액에 동량의 PCI (phenol : Chloroform : isoamylalcohol = 25:24:1)를 넣고 섞어준 뒤, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 동량의 isopropanol을 넣고 섞어 준 뒤, 얼음에 10분간 방치 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 70% 에탄올로 세척하여 상온에서 1시간 동안 건조시킨 후, RE buffer에 녹여 Micro-spectrophotometer K5600 (BioFuture Inc., Toyko, Japan)으로 정량 후 20 ng/µL로 희석하여 다음 실험에 사용하였다.
CAPS 마커 개발
산마루1호와 천장3호에 특이적으로 존재하는 SNP와 Indel은 Hillier 등[23]이 이용한 방법과 유사한 방법을 이용하여 동정하였다. 9개 균주에서 추출한 genomic DNA의 resequencing data를 표고 전장유전체정보와 alignment하여 산마루1호와 천장3호에 특이적으로 존재하는 SNP와 Indel을 선별하였다. 표고 균주의 resequencing은 Healey 등[24]의 방법을 응용하여 Hiseq 2500 platform을 이용하여 수행하였다. 선별한 SNP와 Indel을 중심으로 flanking sequence를 추출하여 matrix를 만들었다. Primer3Plus (http://biotools.umassmed. edu/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 이용해 변이를 포함하는 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하였다(Table 1).
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Table 1. Characteristics of primer sets for identification Sanmaru 1ho and Chunjang 3ho |
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Tm, annealing temperature; Size, size of the fragment amplified with CAPS primers. |
프라이머 디자인 후 PCR은 추출한 genomic DNA 20 ng을 주형으로, 95°C에서 3분, 다시 95°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 20초로 35사이클을 증폭한 후, 추가로 72°C에서 5분간 반응시켰다. B17과 산마루1호, 천장3호의 증폭된 마커 서열을 Sanger sequencing (Cosmogenetech, Seoul, Korea)을 통해 변이를 확인하였다. 변이가 확인된 서열을 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)을 이용해 마커 서열에 특이적인 제한효소를 동정하였다. 실험에 사용된 10개 균주에서 PCR을 통해 증폭한 마커 서열에 제한효소를 처리하고 2.5% agarose gel에 전기영동하여 fragment들을 비교하였다.
결과 및 고찰
산마루1호와 천장3호 특이적 CAPS 마커 선별
산마루1호와 천장3호를 판별할 수 있는 마커 서열을 동정하기 위해 산마루1호와 천장3호를 포함한 총 9개 균주 DNA의 resequencing을 수행하여 시험균주에 대한 genome sequence를 확보하였다. 확보된 9개 균주들의 genome sequence를 표고의 표준유전체인 B17의 전장유전체 정보와 비교하여 SNP와 Indel을 동정했다. Sanger sequencing을 통해 확인해본 결과, 산마루1호의 scaffold9번, 1630048의 염기서열 G가 T로 변한 SNP, 천장3호의 scaffold13번, 920681의 염기서열 G가 A로 변한 SNP가 CAPS 마커를 개발하기에 가장 적합한 서열로 판단되었다(Fig. 1A, 1B).
산마루1호의 특이적인 마커 서열인 <RL-LE-116>과 천장3호의 특이적인 마커 서열인 <RL-LE-134>를 대상으로 하여 CAPS 마커를 동정했다. 산마루1호의 경우 제한효소 TspR I의 인식부위가 존재하지 않았고, 천장3호의 경우 제한효소 Xho I의 인식부위가 존재하지 않았다(Fig. 1A, 1B). 개발한 CAPS 마커를 이용해 산마루1호와 천장3호의 판별이 가능한지를 확인하기 위해, resequencing에 사용한 10개 균주에서 각각 마커 서열을 증폭한 후 제한효소를 처리하였다. 그 결과 산마루1호와 천장3호의 PCR 산물만이 제한효소에 의해 절단되지 않은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1C, 1D). 천장3호의 경우 산마루1호의 마커 서열이 증폭되지 않는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 산마루1호의 마커 서열 프라이머가 천장3호의 유전적 변이 부분을 포함하고 있기 때문일 것으로 추정된다.
CAPS 마커의 특성 및 개발 현황
CAPS는 공우성 마커이기 때문에 heterologous한 유전자형의 분석이 가능하고, 간단한 분석 과정을 통해 안정적인 결과를 얻어낼 수 있다는 장점을 가지고 있다[21, 22]. 딸기, 배와 같은 작물에서는 이미 품종간의 판별을 위한 CAPS 마커가 개발된 바 있으며[20, 25], 또 고추, 밀과 같은 작물에서는 작물의 수량성, 병저항성 등 유용 형질에 관련된 유전자 기반 CAPS 마커가 개발되어 있다[26-28]. 버섯의 경우 양송이에 대한 CAPS 마커는 개발되어 있지만[29], 표고에 대한 마커는 RAPD, ISSR, SRAP, SCAR등과 같은 마커들이 개발되어 있고[8, 11, 12, 14], 아직까지 CAPS 마커는 개발되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서 국내에 유통되고 있는 9개 표고 균주로부터 산마루1호와 천장3호의 구분이 가능한 CAPS 마커를 개발하였다. 이 연구에서 개발된 CAPS 마커는 표고버섯의 품종들 간에 유전적 다양성을 부여함으로써 균주에 대한 정보를 제공하고, 더 나아가 우리나라의 표고 품종을 보호할 수 있는 분자생물학적 근거가 되었다. 이로써 향후 유전자원에 대한 국가간 분쟁을 미연에 방지할 수 있을 것이다.
적요
표고버섯은 주로 아시아 국가에서 재배되는 식용 버섯이다. 표고버섯은 최근 국내에서 신품종의 개발이 활발히 이루어지고 있으며, 국내외적으로 품종의 보호가 중요해짐에 따라 표고의 품종을 구분할 수 있는 효율적인 마커 개발이 요구되고 있다. 본 연구에서는 산마루1호와 천장3호를 구분할 수 있는 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 개발하였다. 이 연구에서 개발된 CAPS 마커는 단핵균주인 B17의 표준유전체 정보와 연구에 사용된 10개 균주의 resequencing 정보를 바탕으로 개발되었다. 산마루1호는 scaffold9번, 1630048의 염기서열 G가 T로 변한 SNP를 포함하여 PCR 후 제한효소 TspR I을, 천장3호는 scaffold13번, 920681의 염기서열 G가 A로 변한 single nucleotide polymorphism (SNP)를 포함하여 PCR 후, 제한효소 Xho I을 처리하였을 때 다른 균주들과 구분되었다. 따라서 이를 마커로 개발하였다.
