서론
인삼 뿌리썩음병균인 Cylindrocarpon destructans는 삼나무 등의 뿌리 부패와 마름병[1], 감자, 당근의 저장병[2], 연, 양파, 시크라멘, 작약, 크로버의 뿌리 부패를 일으키며[3], 식물 및 수목의 근권과 근면에도 부생적으로 흔하게 존재하는 균으로 알려져 있으며[4-7], 국내에서는 인삼 이외에 작약, 딸기에서의 발생이 보고된 바 있다[8].
Matuo와 Miyazawa [1]는 삼나무에서 분리한 C. destructans의 인삼에 대한 병원성 실험에서 병원성이 없거나 약병원성을 보였지만, 인삼 분리균주들은 인삼에 대하여 강한 병원성을 보였고, 인삼 이외의 다른 작물에는 병원성을 나타내지 않아 인삼에서 분리한 균을 새로운 분화형으로 C. destructans f. sp. panacis로 명명한 바 있다. 그러나 작약에서 분리된 C. destructans는 인삼의 뿌리썩음병과 유사한 검은뿌리썩음병을 일으켜 인삼의 경우처럼 작약에 연작 장해를 일으키기 쉽고 다범성임에도 인삼에 대한 병원성은 밝혀진 바 없고 새로운 분류체계에 의한 재분류도 이루어진 바 없다[9].
최근에 Cabral 등 [10]은 internal transcribed spacer (ITS) region, b (beta)-tubulin, translation elongation factor 1-α, histone h3 유전자 등의 염기서열을 이용한 multi-locus 분석과 형태학적 특성을 비교하여 Cylindrocarpon (Nectria/Neonectria) species complex를 Ilyonectria radicicola species complex로 명명하고 complex 내에 존재하는 clade a와 b를 총 17개의 종으로 재분류하였으며, 인삼으로부터 분리된 I. mors-panacis, I. robusta, I. panacis, I. crassa 등 모두 4종이 재정립되었다.
본 연구는 작약에 검은뿌리썩음병을 야기하는 C. destructans가 새로운 분류체계에 의해 재분류하여 인삼으로부터 분리된 종들과의 관련성을 분석하고, 작약 분리균의 인삼에 대한 병원성을 확인하여 인삼에서 뿌리썩음병의 발생 가능성을 밝혔다.
재료 및 방법
공시균주
본 연구에서 사용된 Cylindrocarpon destructans 작약 분리균주(KACC44663)는 경북 의성군의 작약의 뿌리로부터 2004년에 분리한 균으로 국립농업과학원 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였으며, 인삼분리균 CY8051, CY8061은 전형적으로 뿌리썩음병 증상을 보인 인삼으로부터 분리하였다.
채집된 인삼 병반 조직을 흐르는 물에 수세한 후, 건전 부위와 부패 부위의 조직을 1 cm 크기로 절단, 2% NaOCl에 1분간 침지하여 표면 소독하였고, 멸균수로 2~3회 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하였다. 표면 소독된 병든 조직을 water agar 또는 pentachlrornitrobenzene agar (PCNBA) 배지에 올려놓고, 15°C에서 7일간 배양하였다. 배양된 조직에서 자라 나온 균사 중 단균사를 떼어 potato dextrose agar (PDA) 배지에 재분리하였고, 이것을 15°C에서 10일간 배양 후 단포자 분리하여 암조건 하에 15°C에서 배양, 보관하며 추가적인 실험에 이용하였다.
병원성 조사
실내 검정
인삼뿐만 아니라 작약에서 분리된 C. destructans 균주들의 인삼에 대한 병원성을 조사하기 위하여 2% NaOCl로 표면 소독된 2년근 인삼을 준비하였으며 접종원으로 각 균주들을 PDA 배지에 접종 후 20°C에서 14일간 배양하여 사용하였다. 접종때 사용한 플라스틱 박스는 70% 에탄올로 소독한 다음 멸균수로 적신 티슈를 깔고 배양된 균사를 cork borer (직경 5 mm)로 떼어내어 인삼 표면에 올려놓은 후 tip을 이용하여 인삼에 상처를 내고 고정시켰다. 그 후 플라스틱 박스 안에 넣어 20°C 항온기에서 4주간 치상한 다음 이병 정도를 관찰하였다[11].
실외 검정
실외 병원성 검정 역시 인삼과 작약에서 분리된 C. destructans 균주의 인삼에 대한 병원성 유무 및 그 차이를 묘삼에서 조사하였다. 접종원은 PDA 배지에 20°C에서 14일간 배양하여 사용하였다. 배양된 균사조직을 멸균수 40 mL와 함께 마쇄하여 균사현탁액을 만든 후, 묘삼을 침지시킨 후 충남 금산에 위치한 인삼약초연구소의 예정지 관리가 된 연구 포장에서 2013년 5월경 이식하고 3년 후 이병 정도를 확인하였다.
DNA 분리
C. destructans 공시균주들을 순수배양한 다음 genomic DNA를 분리하기 위해 potato dextrose broth (PDB) 배지에 접종하여 20°C에서 정치 배양하였다. 균사를 수확하여 1.5 mL effendorf tube에 넣고 동결건조시켜 마쇄한 후, Doyle [12]의 방법을 적용하여 DNA를 추출하였다.
염기서열을 이용한 유연관계 분석
병원균의 염기서열 분석을 통한 종 동정을 위하여 진핵세포의 chromatin 구조에 관여하는 histone h3 영역으로부터 제작된 CYLH3F와 CYLH3R primer를 이용하여 annealing 온도 62°C, 35 cycles로 PCR을 수행하였다[13].
각 primer 0.5 pmol, 2 ng의 genomic DNA, 0.2 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCL, 1.5 mM MgCl2, 2.5 unit의 Taq DNA polymerase에 멸균수를 첨가하여, 최종 volume을 50 µL로 하였다.
증폭된 PCR 산물은 Macrogen (Seoul, Korea)에 염기서열분석을 의뢰한 후, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 염기서열을 비교하였다.
또한 유연관계 분석을 위한 염기서열은 MEGA6 software를 이용하여 정렬하였고 불분명하게 정렬된 부분은 분석에서 제외하고 작성하였다. 1,000회의 bootstrap 분석을 통해 신뢰도를 평가하였으며, Cabral 등 [10]에 의해 재정립된 I. radicicola species complex 내 종들의 염기서열이 함께 분석되었다.
결과 및 고찰
작약 분리균의 인삼에 대한 병원성
작약으로부터 분리된 C. destructans 균주의 인삼에 대한 병원성 검정을 실시하였다. 실험실 상에서 상처 접종 결과, 인삼에서 분리된 C. destructans CY8051은 11.3 mm로 빠르고 넓게 병반이 펴졌으며, 작약에서 분리된 C. destructans KACC44663은 4.3 mm로 진전 되었다.두 균주 모두 병원성을 확인할 수 있었다(Table 1).
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Table 1. The pathogenicity on roots of ginseng by each Cylindrocarpon destructans isolated from Korean ginseng and peony |
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N.C, negative control; −, No infection |
작약에서 분리된 C. destructans KACC44663 균주가 인삼에 직접 병을 낼 수 있는지 확인하기 위해서 실외 검정을 실시하였다. 인삼에서 분리되었던 균주 중 C. destructans CY8051은 실내 검정 결과와 동일하게 가장 병원성이 강했으며, 작약에서 분리된 C. destructans KACC44663은 인삼분리균인 C. destructans CY8061과 유사하게 인삼에 대해 약한 병원성이 확인되었다(Table 2, Fig. 1).
국내에 알려진 C. destructans의 기주로는 인삼 이외에 작약, 딸기만이 보고되었다[8]. 특히 인삼과 마찬가지로 뿌리를 이용하는 작약에서 분리된 균주의 인삼에 대한 병원성이 밝혀진 바는 없었다. 본 연구를 통해 작약에서 분리된 C. destructans가 작약 외에 인삼에도 병을 일으킬 수 있음이 최초로 확인되었다.
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Table 2. The pathogenicity on roots of ginseng by each Cylindrocarpon destructans isolated from Korean ginseng and peony |
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유연관계 분석을 통한 작약 분리균의 재분류
새로운 분류체계를 토대로 앞서 C. destructans로 동정된 작약 분리균의 계통학적 분석을 실시한 결과, 이 병원균은 Ilyonectria radicicola species complex 내에 포함되는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 국내 인삼 뿌리썩음병반으로부터 분리된 CY8051, CY8061도 같은 complex를 이루었으며, 작약 분리균(KACC44663)은 CY8061과 동일한 I. robusta로 동정되었다.
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Fig. 2. Phylogenetic analysis of Ilyonectria species isolated from Korean ginseng and peony based on the histone H3 gene seguences. The bootstrap analysis was performed with 1,000 replications. |
외국에서는 인삼 뿌리썩음병균으로 I. mors-panacis, I. robusta, I. panacis, I. crassa 등 모두 4 종이 밝혀진 바 있다[10]. 한편 국내에서는 Chung [14]에 의해 최초로 인삼뿌리에서 C. destructans의 발생이 보고된 이후로, Seo 등 [15]은 RAPD 분석에 의해 국내 인삼뿌리썩음병균 집단의 유전적 다양성을 확인했으며, Song 등 [16]은 ITS 영역, mitochondrial small subunit (mt SSU) rDNA의 염기서열을 이용하여 국내 인삼뿌리썩음병균 집단이 외국의 인삼뿐만 아니라 타기주로부터 분리된 C. destructans와 같은 complex를 이루는 것을 확인하였다.
또한 Carbral 등 [10]이 Ilyonectria속 내 종 분류에 사용된 균들의 기주는 I. mors-panacis의 경우 오직 인삼(Panax ginseng, P. quinquefolium) 뿐이었으며, I. robusta는 미국삼, 피나무, 참나무류, Thymus sp., 포도나무 등이었다.
본 연구는 기존에 C. destructans로 동정된 작약 분리균에 대한 분자계통학적 분석을 처음으로 시도하였으며, 작약 분리군이 국내 인삼뿌리썩음병균(CY8061)과 일치하는 것으로 보아 인삼뿌리썩음병을 일으킬 가능성이 있는 것으로 판단되었다.
적 요
작약에서 분리된 Cylindrocarpon destructans KACC44663 균주의 인삼에 대한 병원성 여부를 밝혀내고자 병원성 검정을 실시하였고 새로운 분류체계에 따른 균의 재분류를 위해 계통학적 유연관계를 분석하였다. 작약으로부터 분리된 KACC44663 균주가 인삼에 병을 일으키는 것을 확인하였고, 새로운 분류체계에 의해 I. radicicola species complex 내 위치하는 Ilyonectria robusta로 동정하였다. 이는 국내에서 타 기주로부터 분리된 병원균이 인삼에 뿌리썩음병을 일으키는 것을 증명한 첫 사례이다.
