서 론
염증은 생체 피부 등의 여러 조직에 강한 열이나 강알칼리, 강산 등의 외부 자극원이나 조직의 손상, 감염성 병원체의 침입 등의 다양한 원인에 의하여 유발되며 이러한 염증으로부터 인체를 보호하는 기전 중의 하나가 염증반응이다[1, 2]. 염증반응은 대식세포, 혈관 평활근세포, 내피세포, 간세포와 심근세포 등 여러 세포에서 여러 가지 외부 자극이나 병원체 등에 의해 손상된 조직을 치유하기 위해 국소에서 일어나는 복잡한 생체반응이며 cytokine 등이 관여한다[2]. 그러나 계속된 염증 반응은 조직이 붉게 붓고 열이 나며 본래의 기능을 상실하여 통증을 유발하게 되고 점막손상을 촉진 할 뿐만 아니라, 암, 류머티스 관절염, 동맥경화, 위염, 천식 등을 유발할 수 있다[1]. 또한, 염증반응을 통하여 생성된 nitric oxide는 신호전달과 체내방어, 신경독성 등의 다양한 생리기능성과 종양이나 세균들을 제거하는 기능을 수행한다. 그러나 nitric oxide가 체내에 과도하게 생성, 축적 되면 조직의 손상이나 혈관의 투과성 증가에 의한 부종 등의 염증반응을 활성화시키고 나아가 염증유발물질들의 생합성을 증진시켜 염증을 심화시키므로 인체에 피해를 주게 된다[3]. 따라서 염증 반응에서 염증유발물질인 interferon-
, interleukin1-
등의 cytokine과 nitric oxide synthase, cycloxygense-2 등의 발현 또는 생성 억제를 통하여 nitric oxide와 prostaglandin E2의 생성을 억제시키므로 항염증 효과를 확인할 수 있다. 지금까지 항염증 물질생산에 관한 연구로는 적하수오[4], 홍삼[5], 홍자단[6] 등과 목질진흑버섯[7, 8], 차가버섯(자작나무시루뻔버섯) [9, 10], 말굽버섯[11] 등의 버섯[1, 3, 12] 및 키위[13], 밀배아유[14], 진두발[15] 등 주로 약용식물과 천연물 등의 추출물에서 항염증 효과에 관하여 연구, 보고되었다. 한편, 효모는 진균류의 일종으로 최근 이들로부터 다양한 대사산물의 생산과 이들에 대한 응용성들이 연구되어 항고혈압성 안지오텐신 전환효소 저해물질[16-18]과 항치매성 B-secretase 저해물질[19]과 acetylcholine esterase 저해 물질[20], 혈전용해 활성물질[21], 혈관신생 억제물질[22], 미백성 Tyrosinase 저해물질[23], 정미성 리보핵산 물질[24]과 killer 독성물질[25]과 같은 다양한 생리 기능성 물질 생산과 이들의 특성들이 보고되었다. 그러나, GRAS균이면서 오래 전부터 전통 발효식품 등에 널리 사용되어 오고 있는 효모로부터 항염증 물질의 생산과 산업적 응용에 관해서는 아직 연구되지 않았다. 따라서 효모를 이용하여 새로운 항염물질을 생산하고자 본 연구에서는 필자 등이 최근 몇 년간 야생화 등에서 분리, 동정한 효모 중 비병원성 효모들의 무세포추출물을 제조한 후 이들의 lipopoly-saccharide에 의해 활성화된 RAW264.7 macrophage 세포에서 생성되는 nitric oxide 생성 억제활성을 측정하여 항염증 효과를 가진 우수효모 균주를 선발하였다. 또한 이들의 미생물학적 특성 등을 조사하였다.
재료 및 방법
효모 및 실험재료
실험에 사용한 효모는 배재대학교 생물공학연구실에서 2012년부터 울릉도 등의 주요 섬과 덕유산 등의 주요 산들의 야생화에서 분리, 동정한 야생효모 중 비 병원성 효모 182 균주를 사용하였다[26-30]. Dulbecco’s Modified Eagle 배지(HyClone, South Logan, UT, USA)와 Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 등을 세포배양에 사용하였다. lipopolysaccharide (E. coli B0111:B4; Sigma-Aldrich)와 Griess시약 등을 nitric oxide (NO) 정량에 사용하였으며, 기타 시약들은 분석용 특급을 사용하였다.
효모 배양 및 무세포 추출물 제조
비병원성 야생효모 182 균주를 yeast extract-peptone-dextrose (YPD) 배지에 접종하여 30°C에서 24시간 배양한 후 원심분리(12,000 rpm, 20 min, 4°C)하여 침전된 cell pellets을 얻었다. 다시 Tris-HCL buffer로 3번의 세척 후 bead를 이용하여 세포를 파쇄한 다음 원심분리한 후 상층액을 모아 동결건조하여 무세포 추출물을 제조하였다.
세포배양
대식세포 계열인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행에서 분양 받아 실험에 사용하였다. 10% Fetal Bovine Serum과 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle 배지에 세포를 접종하여 37°C, CO2 incubator에서 배양하였다. 약 80~90%의 세포들이 생육하였을 때 계대배양을 하였다[1, 31].
Nitric oxide 생성 저해율 측정
RAW 264.7 세포에서 생성되는 활성질소인 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 측정하였다[1]. 먼저 RAW 264.7 세포를 1 × 105 cells/mL로 48-well plate에 150 µL를 분주하고 2시간 후에 효모 무세포 추출물을 100, 250, 500, 750, 1,000 µg/mL로 30 µL씩, lipopoly-saccharide (LPS)를 1 µg/mL로 30 µL씩 분주한 후 37°C에서 CO2 incubator로 24시간 배양하였다. 활성화시킨 RAW 264.7 세포배양액 100 µL를 96-well plate에 옮겨 Griess 시약 100 µL와 혼합하여 상온에서 10분간 반응 시킨 후 microplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO 함량을 NaNO2의 표준곡선을 이용하여 측정하였다[1, 3]. 또한 아래와 같이 NO 생성 저해율을 계산 하였다.
NO 생성 저해율(%) = [(C ― T) / C] ×100
(T: 시료첨가구의 A540, C: 무첨가구의 A540)
결과 및 고찰
효모 무세포 추출물들의 nitric oxide 생성 저해활성
우리나라 주요 섬에서 분리하여 선별한 비병원성 효모들의 무세포 추출물들의 NO 생성 저해활성들을 측정한 결과는 Table 1, 2와 같다. 먼저 전라북도 선유도 분리 효모 균주들에서는 Metschnikowia reukaufii SY20-7, Rhodotorula ingeniosa SY1-1, Yarrowia lipolytica SY51-1, SY51-3 균주들의 무세포 추출물들이 30% 이상의 NO 생성 저해활성을 보였고 이들 중 Metschnikowia reukaufii SY20-7이 38.7%로 가장 높은 NO 생성 저해활성을 보였다.
경상남도 욕지도 분리 효모 균주들에서는 Meyerozyma guilliermondii YJ34-2, Rhodotorula graminis YJ36-1, Rhodotorula nothofagi YJ1-1, YJ22-2 균주들의 추출물들이 30% 이상의 NO 생성 저해활성을 보였고 Rhodotorula graminis YJ36-1의 무세포추출물이 57.4%로 가장 높았다. 경상북도 울릉도 분리 효모 균주들에서는 Metschnikowia koreensis UL32-1의 무세포추출물이 32.7%를 보였고 Sporobolomyces carnicolor UL32-3이 37.2%의 NO 생성 저해활성을 보였을 뿐 여타의 균주들은 30% 미만의 저해활성을 보였다.
그러나 대전광역시의 계족산, 충청남도 오서산, 전라북도 덕유산, 전라남도 백암산 등의 분리효모 균주들에서는 30% 이상의 NO 생성 저해활성을 보이는 균주들은 없었다(Table 3).
이상의 결과들을 종합하였을 때 유포자효모인 Rhodotorula graminis YJ36-1와 무포자효모인 Meyerozyma guilliermondii YJ34-2균주의 무세포추출물들이 각각 57.4%와 47.0%의 비교적 높은 NO 생성 저해활성을 보여 항염물질 생산 우수 효모균주들로 최종 선발하였다.
지금까지 항염증물질 생산 연구는 주로 약용 식물들과 일부 버섯자실체들의 추출물들을 대상으로 실시되어왔고[4-15, 31], Nguyen 등[3]은 산느타리 버섯의 메탄올 추출물에 함유되어 있는 페놀성 물질이, Park 등[11]은 말굽버섯의 메탄올 추출물에 함유되어 있는 fomentariol 물질이 항염활성을 나타낸다고 보고하였다.
본 연구는 비병원성이며 영양요구성이 단순하고 배양이 비교적 용이하여 산업적 응용성이 클 뿐만 아니라 진균으로서 대체의약이나 건강소재 개발에 매우 유리한 효모로부터 항염증물질 생산이 가능함을 처음 제시하고 있다. 현재, 선발 균주들의 세포독성과 이들을 이용한 항염증물질 대량생산 조건의 최적화 및 물질특성 규명 등에 관한 추가의 연구가 진행되고 있다.
항염활성 우수효모들의 미생물학적 특성
항염물질생산 우수균주로 최종 선발된 Rhodotorula graminis YJ36-1과 Meyerozyma guilliermondii YJ34-2의 계통수는 Fig. 1과 같고 이들의 미생물학적 특성을 조사한 결과는 Table 4와 같다. 두 균주 모두 타원형으로 출아법으로 무성생식 하였고 YPD, YM, PD, vitamin-free 배지에서 잘 생육하였으며 5% NaCl이 함유된 YPD 배지에서 잘 생육하는 내염성 효모들이었다.
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Table 4. Microbiological characteristics of the finally selected anti-inflammatory yeasts YPD, yeast extract-peptone-dextrose; O, Oval; B, Budding; P, Pink; C, Cream. |
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각 균주들의 특성을 보면 Rhodotorula graminis YJ36-1는 위균사와 자낭포자를 형성하였고 크기는 1.5 × 0.8 µm 이었으며 15~25°C와 pH 4~8에서 잘 생육하였다. YPD 한천 배지에서 형성된 colony의 색은 핑크색이었고 xylose, D-glucose, D-galactose, D-cellobiose, D- maltose, D-saccharose, D-melezitose, D-raffinose, adonitol, xylitol, glycerol, calcium 2- keto-gluconate, methyl-⍺D-glucopyranoside 등을 자화시켰으나 이들 모두 발효시키지 못했다.
Meyerozyma guilliermondii YJ34-2는 위균사와 자낭포자를 형성하지 않았고 크기는 1.5 × 1.0 µm 이었으며 15~40°C와 pH 4~7에서 잘 생육하였다. YPD 한천 배지에서 형성된 colony의 색은 크림색이었고 L-arabinose, xylose, D-glucose, D-galactose, D-cellobiose, D-maltose, D-saccharose (sucrose), D-trehalose, D-melezitose, D-raffinose, adonitol, xylitol, glycerol, calcium 2-keto-gluconate, methyl-⍺D-glucopyranoside, N-acetyl-gluco-samine 등의 탄소원들을 자화시켰으나 L-arabinose, D-glucose, D-saccharose 만을 발효시켰다.
