내생균(endophytic fungi)은 살아 있는 식물의 식물체에서 병증을 유발하지 않으며 공생하는 균류를 의미하는데[1], 식물체의 잎과 뿌리, 줄기 등 모든 조직 내에 서식하고 있다. 특히 식물의 잎에 서식하는 내생균은 병원체로 작용하는 미생물의 잎 조직으로의 침투를 제한하는 역할을 하기도 하고[2], 식물의 포식자에게 독소가 될 수 있는 alkaloid 형태의 2차 대사산물을 분비하기도 한다[3]. 최근에는 내생균들이 잎 조직 내에서 분비하는 이러한 물질들이 다른 미생물 병원체에 대한 항생 효과 또한 낼 수 있다는 사례들이 연구되면서[4, 5], 식물의 잎에서 분리된 내생균에 대한 연구와 균주 확보의 중요성이 점차 높아지고 있다. 본 연구에서는 우리나라의 다양한 식물의 잎에서 내생균을 분리하여 다양성을 조사하는 연구를 진행하던 과정에서 충북 단양의 아로니아(Aronia melanocarpa)와 전북 부안의 소나무(Pinus densiflora)의 잎에서 5종의 국내 미기록 내생균을 분리하여 그 균의 형태적 특징과 계통 분석 결과를 보고하고자 한다.
아로니아는 충청북도 단양군 적성면 현곡리의 아로니아 재배 농경지(N36°57'05.5", E128°18'01.3")에서 채집되었고, 소나무는 전북 부안군 주산리 사산면의 산림(N35°39' 23.3", E126°40'59.2")에서 채집되었다. 채집된 시료는 지퍼백에 담아 24시간 내에 실험실로 운반하여 외관상 병증이 없는 잎 시료를 선별하여 증류수로 세척 후 30% H2O2로 30초~1분간 처리하여 표면을 살균하였다. 표면 살균 시간은 잎의 면적에 따라 다르게 수행하였다. 표면살균 후 잎을 potato dextrose agar (PDA) 배지에 4조각씩 치상하였고 25°C 암소에서 배양한 후 균사가 뻗어 나오면 새로운 PDA 배지에 계대배양하였다. 순수 분리된 균주는 PDA 배지와 malt extract agar (MEA) 배지에서 7일간 배양하여 형태학적 특징을 관찰하였다(Fig. 1).
DNeasy Plant mini kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)을 사용하여 Genomic DNA를 추출하였으며, 이 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 모든 균주의 DNA는 균 특이적 primer인 ITS1F와 ITS4를 이용하여 internal transcribed spacer (ITS) 지역을 증폭하였고[6], primer LR0R과 LR16을 이용하여 ribosomal DNA의 large subunit (LSU) 지역을[7], 그리고 primer Bt2a과 Bt2b를 이용하여 β-tubulin (TUB) 영역을 증폭하였다[8]. PCR 조건 중 annealing 온도는 ITS 지역은 50°C, LSU rDNA 지역은 44°C, β-tubulin 영역은 58°C로 설정하여 수행하였으며, PCR 최종 산물은 1.5% agarose gel에서 20분 간 전기영동을 실시하였고, 예상되는 크기의 DNA band를 확인한 후 염기서열 분석을 의뢰하였다(SolGent, Daejeon, Korea). 분석된 염기서열은 NCBI상에서 BLAST를 이용하여 유사도를 확인한 후 각 종들 간의 계통 분석을 통한 유연 관계를 확인하기 위해 MEGA6를 이용하여[9], neighbor- joining 계통수를 작성하였다(Table 1, Figs. 2~5). 분리된 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, 염기서열은 GenBank에 제출하였다(Table 2).
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Table 1. Fungal strains used in phylogenetic analysis, including outgroups |
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ITS, internal transcribed spacer; LSU, large subunit; TUB, β-tubulin. |
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Table 2. GenBank accession numbers and NIBR numbers for fungal strains isolated from this this study |
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Pestalotia lawsoniae Mundk. & Khesw. Mycologia 34: 315 (1942)
PDA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 42~45 mm 정도로 매우 빠르게 자라며, 균총의 색은 앞뒷면 모두 전체적으로 흰색이다. 고도는 중앙부에서 볼록 융기되어 있고 중앙부에서부터 가장자리로 공중균사가 형성되어 방사형으로 뻗어 나간다(Fig. 1A). MEA 배지에서 배양된 균총의 직경은 44~45 mm 정도이고 형태적 특성은 PDA 배지에서 배양된 균주와 대부분 일치하나 색이 전체적으로 연한 갈색을 띤다(Fig. 1F). NCBI 상에서 ITS 지역의 분석결과 P. lawsoniae AY687872와 100.0%의 일치도를 확인하였고, LSU 지역의 분석결과 HM535714와 98.0%의 유사도를, TUB 지역의 분석결과 DQ333577과 97.0%의 유사도를 확인하였다. Pestalotia속은 1841년 De Notaris에 의해 명명되었으며[10], Pestalotiopsis와 같이 Amphisphaeriaceae에 속한다. Pestalotiopsis속과 비슷한 형태적 특성을 공유하고 실제로 후속 연구에 의해 Pestalotiopsis속으로 수정된 종들이 존재한다[11]. 이 종은 Lawsonia속에 속하는 목본식물인 Lawsonia alba의 잎에서 분리된 것에서 최초 유래되었으며, 원 기재문에서는 숙주식물의 잎에 반점(leaf spot)을 발생시키는 병원성 균류로 기록되었다[12]. 본 연구에서는 소나무 잎에서 분리한 내생균이며, Pinus속의 침엽수 잎에서 내생균으로 분리된 기록도 존재한다[13].
Pestalotiopsis chamaeropis Maharachch., K. D. Hyde & Crous, Stud Mycol 79: 158 (2014)
PDA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 42~45 mm 정도이고, 앞면은 중앙부는 올리브색이고 주변부는 흰색의 공중 균사로 덮여 있다. 뒷면의 색은 중앙부는 베이지색이고 주변부는 흰색이며, 균총의 고도는 융기되어 있으며, 가장자리는 불규칙한 형태이다(Fig. 1B). MEA 배지에서 7일간 배양한 균총의 직경은 42~45 mm 정도이고, PDA 배지에서 배양한 균주와 형태적 특성이 일치하나 뒷면 균총의 중앙부에서 방사형으로 주름이 있다(Fig. 1G). 분지된 균사 끝에서 분생자를 형성하는데, 분생자는 격벽이 있으며 검은색의 세포층으로 나뉘어 있고, 바깥층은 투명한 무색의 유리질 막이 감싸고 있다. 분생자의 크기는 13.9~23.2 × 9.0~10.9 µm이다(Fig. 1K). ITS 지역의 염기서열은 KR259104와 99.0%, LSU 지역은 KM116217과 99.0%, 그리고 TUB 지역은 KR259103과 98.0%의 유사도를 나타냈다. Pestalotiopsis속은 1949년 Steyaert [11]에 의해 최초로 명명된 속으로, 검은 색의 분생포자층(acervulus)이 불규칙하게 혹은 균열이 있는 상태로 종방향으로 길게 뻗어 나가며, 유리질의 격막으로 분리된 갈색의 분생자를 형성하는 것이 특징이다. 본 연구에서 이 균주는 아로니아의 잎에서 분리되었으며, 이탈리아에서는 야자나무과(Arecaceae)에 속하는 식물인 Chamaerops humilis의 잎에서 분리된 내생균으로 보고되었다[14, 15].
Pestalotiopsis jesteri Strobel, J.Yi Li, E. J. Ford & W. M. Hess. Mycotaxon 76: 260 (2000)
PDA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 31~33 mm 이며, 균총의 앞뒷면은 중앙부는 청록색을 띠는 흰색이며 가장자리에 흰색의 띠가 생긴다. 가장자리의 띠는 7일 이상 배양하면 파도형으로 여러 층을 형성하여 점차 나이테와 같은 형태로 자란다. 균사는 중앙부에서 성기고 가장자리로 갈수록 조밀해져 전체적으로 방사형을 이룬다. 균총의 고도는 배지에 납작 붙어 있는 형태이다(Fig. 1C). MEA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 35~40 mm 정도로 PDA 배지에 배양할 때보다는 약간 크게 자라고, 균총의 앞면 중앙부는 아이보리색이며 가장자리는 흰색을 띤다. 뒷면은 중앙부에서 연한 갈색을 띠며 가장자리는 흰색이다. 가장자리에는 방사형의 공중균사가 발달하고, 고도는 볼록 융기된 형태이다(Fig. 1H). 분생자는 3중의 격벽에 의해 2개의 세포로 분리된 방추형 혹은 타원형이고, 색깔은 진한 갈색이며 크기는 11.8~14.4 × 5.5~6.7 µm 정도이다(Fig. 1L). ITS 지역의 염기서열은 KM199380과 98.0%, LSU 지역은 KM116281와 99.0%, TUB 지역은 KM199468과 98.0%의 유사도를 나타냈다. 이 종은 파푸아뉴기니의 용담과(Gentianaceae) 식물의 줄기에서 처음으로 분리되었다[14]. Pestalotiopsis에 속하는 내생균들 중 일부는 항생 작용을 하는 alkaloid를 분비하는 것으로 알려져 있는데, Pestalotiopsis microspora와 Pestalotiopsis guepinii의 경우 Taxus와 Wollemia속의 침엽수 잎에서 항암성분인 taxol을 생산하는 것으로 보고되어 있으며[16, 17], 이 종 역시 침엽수의 잎에서 항진균성 물질인 jesterone을 분비하는 것으로 보고되었다[18].
Stagonosporopsis cucurbitacearum (Fr.) Aveskamp, Gruyter & Verkley, Stud Mycol 65: 45.
PDA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 44~45 mm 정도로 매우 빠르게 자라며, 앞뒷면이 전체적으로 무색에 가까운 흰색을 띠며 가장자리는 undulate 형태이다. 균총의 표면에는 전체적으로 작은 점 형태의 사마귀(wart)들이 밀집해 있으며, 균총의 고도는 배지에 납작하게 붙은 형태이다(Fig. 1D). MEA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 31~35 mm 정도로 PDA 배지에서 보다 느리게 자라며, 대부분의 형태적 특성은 PDA배지에서 배양된 균총과 일치하나 균총의 앞뒷면 색깔이 베이지색에 가깝고 균사가 가장자리로 가면서 방사형으로 뻗어 나가는 점이 다르다(Fig. 1I). 첫 번째 형태의 분생자(type 1)는 원통형 혹은 타원형으로 길쭉한 형태이며 크기는 10.0~10.1 × 2.7~4.2 µm 정도이고(Fig. 1M), 두 번째 형태의 분생자(type 2)는 구형에 가까운 모양으로 직경은 4.2~5.4 µm 정도였다(Fig. 1N). ITS 지역의 염기서열은 KM489071과 98.0%, LSU 지역은 EU167563과 100%, TUB 지역은 KY930337과 97.0%의 일치도를 확인하였다. 본 균주는 아로니아의 잎에서 분리되었으며, 원 기재문 내에 Stagonosporopsis에 해당하는 종들이 타원형 혹은 구형의 두 가지 형태의 분생자를 형성한다고 기록되어 있는데[19], 본 연구에서도 두 가지 형태의 분생자를 확인할 수 있었다. 인간에게 급성 칸디다증을 유발하는 원인균인 Candida albicans에 대해 항생 효과를 보이는 pyridone 계열의 alkaloid 물질을 분비하는 것으로 연구된 바 있다[20]. Stagonosporopsis속은 1912년 Diedicke에 의해 최초로 명명된 속으로[21], Stagonospora속과 비슷하게 multi-septate형의 분생자를 생성하는 것이 특징이고[21], Stagonosporopsis oculihominis는 난초과(Orchidaceae)에 속하는 식물인 Dendrobium huoshanense의 줄기에서 내생균으로 작용하며, alkaloid를 분비하여 병원성 균류에 대한 내성을 제공하는 것으로 알려져 있다[22].
Zasmidium fructicola Crous, F. Huang & Hong Y. Li, Mycologia 107: 1165 (2015)
PDA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 13~15 mm로 중앙부에 균사가 밀집하여 느리게 자라고, 앞면은 중앙부는 회색빛이며 가장자리에 약간의 어두운 녹색(dark green)을 띤다. 뒷면은 전체적으로 검은색이며, 균총의 고도는 낮아, 납작하게 붙어있으며 배지 속으로 들어 가는 형태이다(Fig. 1E). MEA 배지에서 7일간 배양된 균총의 직경은 15~20 mm 정도로 PDA에서보다 크게 자란다. 형태적 특성은 PDA 배지에서 배양된 균주와 일치한다(Fig. 1J). 분생자의 형태는 장타원형 혹은 원통형의 분생자경(conidiophore) 끝에서 분지되어 형성되는 것을 관찰할 수 있다[23]. 분생자의 색은 연하거나 진한 갈색이며, 크기는 22.6~27.9 × 12.4~15.8 µm이다(Fig. 1O). ITS 지역의 염기서열은 KP896053와 99.0%, LSU 지역은 KP895915와 99.0%, TUB 지역은 KP896138과 99.0%의 일치도를 확인하였다. Zasmidium속은 Mycosphaerellaceae에 속하는 균류로, conidium은 격벽이 구분되지 않으며 표면에 치아 형태의 중심축이 자리잡고 있는 것이 특징이다[24]. 원 기재문에서는 감귤류에 속하는 과실수의 잎 혹은 열매에서 갈색무늬병의 병증이 있는 조직에서 분리되었으나[23] 본 연구에서는 소나무의 병증이 없는 침엽에서 분리되었다. 최근 Zasmidium속에 속하는 종이 알래스카에 서식하는 침엽수 잎에서 내생균으로 분리된 결과가 있다[25].
