서 론
Didymella는 Phoma의 유성세대에 속하는 분류군으로, 이들은 다계통분류체계(polyphyletic group)를 가진 속이다. Didymella는 처음에는 Mycosphaerellaceae, 그 다음은 Pleosporaceae, Phaeosphaeriaceae, Venturiaceae에서 Pleosporales의 incertae sedis로 분류됐다가 de Gruyter 등[1]에 의해 재분류되는 과정에서 새롭게 생긴 Didymellaceae과에 포함되었다. Didymellaceae는 “Didymella clade”를 위한 분류군으로서 Pleosporales 중 가장 많은 종을 가지고 있는 과이며, 다양한 서식지에 넓게 분포하고 있다. 그 중 Ascochyta속, Didymella속, Phoma속이 많은 비중을 차지하고 있으며, 광범위한 감염 범위를 가진 식물병원균으로서 식물체의 잎과 줄기에 병반을 형성한다[2]. 현재까지 국내에 보고된 Didymella속은 멜론에 덩굴마름병을 일으키는 것으로 알려진 D. bryoniae만이 알려져 있다[3]. Phoma속에 속하는 종들을 재동정 할 경우 국내에도 많은 종이 존재하고 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 Chen 등[2]에 의해서 보고된 Didymella속의 3종, D. segeticola, D. ellip-soidea, D. aeria 균류를 국내의 담수환경에서 발굴하였으며, 이를 국내 최초로 보고하였다.
재료 및 방법
강원도 삼척시 및 경상북도 김천, 제주의 담수지역에서 침전식물체 및 토양을 채집하였다. 강원 삼척지역에서 담수 침전 식물체를 부식된 식물 잎을 폴리에틸렌 봉투에 채집하였다. 경북 김천 및 제주 지역에서는 하천의 물 아래에 분포하는 토양을 conical tube 담아 채집하였다. 시료는 수분이 있는 상태에서 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 채집한 담수 침전 식물체 및 담수토양에서 균을 분리하였다. 채집한 담수 침전 식물체를 멸균수에 2번 세척한 후 멸균수에 넣고 20°C에서 하루 정도 배양한 후, 배양된 물 100 µL를 water agar (WA, 20 g/L, agar)에 도말하고 2일 동안 15°C에서 배양하였다. 채집한 토양시료는 101, 102, 103으로 희석하여 200 µL를 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA)에 도말한 후 3~4일 동안 15°C에서 배양하였다. 배양된 배지에서 단포자 분리를 통해 곰팡이를 순수분리하였다. 순수 분리된 균류는 PDA에 접종하고 20°C 또는 25°C에 배양하며 실험에 사용하고, 일부는 15% 글리세롤에 담은 후 ‒80°C에 저장하였다.
낙동강 유역의 담수침전식물체 및 담수토양에서 분리된 균류는 PDA에 배양하여 균사체를 수확하였다. 수확한 균사를 glass bead가 담긴 tube에 넣어 균질화시킨 후 Macherey- Nagel NucleoSpin Plant II DNA extraction Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 internal transcribed spacers (ITS) rDNA, 28S rDNA, β-tubulin 유전자 부분을 증폭시키기 위해 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3')/ ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), LR0R (5'-ACCCGCTGAACTTA AGC)/LR7 (5'-GCAGATCTTGGTGGTAG-3') 및 Bt2a (5'-GGTAACCAAATCGGTGC TGCTTTC-3')/Bt2b (5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3') primer를 사용하여 PCR 하였다[4]. DNA 염기서열 정렬 및 편집을 위해 Clustal X2.1 [5]와 Bioedit 7.2.5 [6]를 사용하였고, 계통수 작성을 위해 MEGA 6.07 [7]을 사용하였다.
환경조건에 따른 생장률을 조사하기 위해 5°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 45°C의 7개 온도 범위와 PDA, malt extract agar (MEA), oatmeal agar (OA; Difco) 등 8가지 배지 종류를 실험에 사용하였다. 각각의 배지를 90 mm 페트리 플레이트에 조제하여 5일 동안 배양한 후 균사생장을 측정하였다. 3반복으로 실시하였다. 실험에 사용한 배지는 PDA, MEA (malt extract 2%; agar 2%/1 L), OA, Czapeck-dox solution agar (CDA; Difco), corn meal agar (CMA; Difco), yeast extract peptone dextrose agar (YPDA; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands), Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18; Merck Millipore, Billerica, MA, USA), potato carrot agar (PCA; HiMedia, Mumbai, India)이다.
결과 및 고찰
Didymella segeticola Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 2
Didymella segeticola는 Chen 등[8]에 의해 발견된 Phoma segeticola를 Chen 등[2]에 의해 재명명된 종이다. 종 이름은 기주식물인 Cirsium segetum Bunge에서 기인하여 명명되었다.
Conidiomata: 병자각(pycnidium)은 25°C 이상의 배지 상에서 잘 형성되고, 독립되어 있거나 여러 개가 결합한 형태이며, 원형 또는 약간 타원형의 모양이지만 대부분 모양이 일정하지 않고, 어두운 갈색에서 검은색이며, 균사체에 덮여 있지 않다. 크기는 127~189(~573) µm× 129~197(~491) µm이다.
Conidia: 원형 또는 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지고 있으며, 투명하고 격벽을 가지고 있지 않다. 크기는 3~5 µm× 2~3 µm이다.
Culture characteristics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 97 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하며, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있다. 가장자리는 녹색을 띠며 가운데는 흰색을 띤다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 81 mm로 생장하며, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 덮여 있으며, 연한 녹색을 띤다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 86 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있고, 가장자리는 흰색을 띠며 가운데로 갈수록 녹색에서 연한 카키색을 띤다. 온도 및 배지별 생장을 조사한 결과, 25°C의 PDA 배지에서 생장률이 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 강원도 삼척시, 담수침전식물체, 2015년 10월 13일 채집, NNIBRFG108, 국립낙동강생물자원관
Synonym: Phoma segeticola Q. Chen
Didymella ellipsoidea Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 3
D. ellipsoidea은 포자모양이 타원형(ellipsoidal)인데서 기인하여 명명되었으며, Chen 등[2]에 의해 보고되었다.
Conidiomata: 병자각은 25°C 이상의 배지 상에서 잘 형성되고, 하나의 독립된 병자각으로 존재한다. 원형 또는 약간 타원형으로 일정한 형태를 가지며, 갈색 또는 어두운 갈색을 띠고, 균사에 덮여 있지 않다. 크기는 149~256 µm×176~287 µm이다.
Conidia: 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지고 있으며, 투명하고 격벽을 가지고 있지 않다. 크기는 3~4.5 µm×2~3 µm이다.
Culture characterisitics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 79 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하며, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여있다. 콜로니 색은 올리브색에서 어두운 올리브색이다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 76 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여있고, 밝은 녹색이다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 73 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며, 밝은 올리브색에서 어두운 올리브색을 띤다. 생장률은 25°C, PDA 배지에서 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 제주도 제주시, 토양, 2016년 3월 22일 채집, NNIBRFG1139, 국립낙동강생물자원관
Didymella aeria Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 4
D. aeria는 공기 중에서 분리된 종으로 Chen 등[2]에 의해 보고되었다.
Conidiomata: 병자각은 독립되어 있거나 여러 개가 결합된 형태이며, 원형 또는 약간 타원형의 모양이지만 형태가 일정하지 않고, 어두운 갈색이며, 균사체에 덮여 있다. 크기는 100~134 µm×104~145 µm이다.
Conidia: 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지며, 포자색은 투명하고, 격벽이 없다. 크기는 3~5 µm×2~3 µm이다.
Culture characteristics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 61 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 콜로니는 중심에서부터 방사형으로 갈라지고, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며 콜로니색은 녹색에서 회녹색을 띤다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 66 mm로 생장하고, 가장자리는 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태이며, 콜로니는 녹색에서 어두운 녹색을 띤다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 60 mm로 생장하고, 가장자리는 일정하다. 콜로니 중심에서부터 방사형으로 갈라지고, 균사체는 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며, 백녹색에서 밝은 녹색을 띤다. 온도 및 배지별 생장을 조사한 결과, 20°C 또는 25°C에서 생장이 좋았으며, PCA 배지에서 생장률이 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 경상북도 김천시, 토양, 2016년 3월 23일 채집, NNIBRFG-1480, 국립낙동강생물자원관