서 론
Didymella는 Phoma의 유성세대에 속하는 분류군으로, 이들은 다계통분류체계(polyphyletic group)를 가진 속이다. Didymella는 처음에는 Mycosphaerellaceae, 그 다음은 Pleosporaceae, Phaeosphaeriaceae, Venturiaceae에서 Pleosporales의 incertae sedis로 분류됐다가 de Gruyter 등[1]에 의해 재분류되는 과정에서 새롭게 생긴 Didymellaceae과에 포함되었다. Didymellaceae는 “Didymella clade”를 위한 분류군으로서 Pleosporales 중 가장 많은 종을 가지고 있는 과이며, 다양한 서식지에 넓게 분포하고 있다. 그 중 Ascochyta속, Didymella속, Phoma속이 많은 비중을 차지하고 있으며, 광범위한 감염 범위를 가진 식물병원균으로서 식물체의 잎과 줄기에 병반을 형성한다[2]. 현재까지 국내에 보고된 Didymella속은 멜론에 덩굴마름병을 일으키는 것으로 알려진 D. bryoniae만이 알려져 있다[3]. Phoma속에 속하는 종들을 재동정 할 경우 국내에도 많은 종이 존재하고 있을 것으로 판단된다.
본 연구에서는 Chen 등[2]에 의해서 보고된 Didymella속의 3종, D. segeticola, D. ellip-soidea, D. aeria 균류를 국내의 담수환경에서 발굴하였으며, 이를 국내 최초로 보고하였다.
재료 및 방법
강원도 삼척시 및 경상북도 김천, 제주의 담수지역에서 침전식물체 및 토양을 채집하였다. 강원 삼척지역에서 담수 침전 식물체를 부식된 식물 잎을 폴리에틸렌 봉투에 채집하였다. 경북 김천 및 제주 지역에서는 하천의 물 아래에 분포하는 토양을 conical tube 담아 채집하였다. 시료는 수분이 있는 상태에서 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 채집한 담수 침전 식물체 및 담수토양에서 균을 분리하였다. 채집한 담수 침전 식물체를 멸균수에 2번 세척한 후 멸균수에 넣고 20°C에서 하루 정도 배양한 후, 배양된 물 100 µL를 water agar (WA, 20 g/L, agar)에 도말하고 2일 동안 15°C에서 배양하였다. 채집한 토양시료는 101, 102, 103으로 희석하여 200 µL를 potato dextrose agar (PDA; Difco, Detroit, MI, USA)에 도말한 후 3~4일 동안 15°C에서 배양하였다. 배양된 배지에서 단포자 분리를 통해 곰팡이를 순수분리하였다. 순수 분리된 균류는 PDA에 접종하고 20°C 또는 25°C에 배양하며 실험에 사용하고, 일부는 15% 글리세롤에 담은 후 ‒80°C에 저장하였다.
낙동강 유역의 담수침전식물체 및 담수토양에서 분리된 균류는 PDA에 배양하여 균사체를 수확하였다. 수확한 균사를 glass bead가 담긴 tube에 넣어 균질화시킨 후 Macherey- Nagel NucleoSpin Plant II DNA extraction Kit (Macherey-Nagel, Bethlehem, PA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 internal transcribed spacers (ITS) rDNA, 28S rDNA, β-tubulin 유전자 부분을 증폭시키기 위해 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3')/ ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), LR0R (5'-ACCCGCTGAACTTA AGC)/LR7 (5'-GCAGATCTTGGTGGTAG-3') 및 Bt2a (5'-GGTAACCAAATCGGTGC TGCTTTC-3')/Bt2b (5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3') primer를 사용하여 PCR 하였다[4]. DNA 염기서열 정렬 및 편집을 위해 Clustal X2.1 [5]와 Bioedit 7.2.5 [6]를 사용하였고, 계통수 작성을 위해 MEGA 6.07 [7]을 사용하였다.
환경조건에 따른 생장률을 조사하기 위해 5°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 45°C의 7개 온도 범위와 PDA, malt extract agar (MEA), oatmeal agar (OA; Difco) 등 8가지 배지 종류를 실험에 사용하였다. 각각의 배지를 90 mm 페트리 플레이트에 조제하여 5일 동안 배양한 후 균사생장을 측정하였다. 3반복으로 실시하였다. 실험에 사용한 배지는 PDA, MEA (malt extract 2%; agar 2%/1 L), OA, Czapeck-dox solution agar (CDA; Difco), corn meal agar (CMA; Difco), yeast extract peptone dextrose agar (YPDA; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands), Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18; Merck Millipore, Billerica, MA, USA), potato carrot agar (PCA; HiMedia, Mumbai, India)이다.
결과 및 고찰
Didymella segeticola Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 2
Didymella segeticola는 Chen 등[8]에 의해 발견된 Phoma segeticola를 Chen 등[2]에 의해 재명명된 종이다. 종 이름은 기주식물인 Cirsium segetum Bunge에서 기인하여 명명되었다.
Conidiomata: 병자각(pycnidium)은 25°C 이상의 배지 상에서 잘 형성되고, 독립되어 있거나 여러 개가 결합한 형태이며, 원형 또는 약간 타원형의 모양이지만 대부분 모양이 일정하지 않고, 어두운 갈색에서 검은색이며, 균사체에 덮여 있지 않다. 크기는 127~189(~573) µm× 129~197(~491) µm이다.
Fig. 1. Neighbor-joining tree of a concatenated alignment of internal transcribed spacer (ITS), 18S, 28S rDNA region and β-tubulin of three Didymella species including D. segeticola, D. ellipsoidea and D. aeria from deposited plant litter and soil. Neoascochyta europaea and N. paspali were used as an outgroup. Bootstrap values higher than 50% from 1,000 replications were shown above/below branches.
Conidia: 원형 또는 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지고 있으며, 투명하고 격벽을 가지고 있지 않다. 크기는 3~5 µm× 2~3 µm이다.
Culture characteristics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 97 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하며, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있다. 가장자리는 녹색을 띠며 가운데는 흰색을 띤다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 81 mm로 생장하며, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 덮여 있으며, 연한 녹색을 띤다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 86 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있고, 가장자리는 흰색을 띠며 가운데로 갈수록 녹색에서 연한 카키색을 띤다. 온도 및 배지별 생장을 조사한 결과, 25°C의 PDA 배지에서 생장률이 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 강원도 삼척시, 담수침전식물체, 2015년 10월 13일 채집, NNIBRFG108, 국립낙동강생물자원관
Synonym: Phoma segeticola Q. Chen
Fig. 2. Colony shape and conidia and growth rate of Didymella segeticola NNIBRFG108. A, colony shape on potato dextrose agar (PDA); B, colony shape on malt extract agar (MEA); C, colony shape on oatmeal agar (OA); D, colony shape on potato carrot agar (PCA); E, colony shape on corn meal agar (CMA); F, colony shape on Czapeck-dox solution agar (CDA); G, colony shape on Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18) agar; H, colony shape on yeast extract peptone dextrose agar (YPDA); I, pycnidia on PDA plate, ×50; J, pycnidium focused under light microscope, ×400; K, conidia on PDA at 25°C, ×400; L, growth rate (scale bars: I = 500 µm, J = 10 µm, K = 10 µm).
Didymella ellipsoidea Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 3
D. ellipsoidea은 포자모양이 타원형(ellipsoidal)인데서 기인하여 명명되었으며, Chen 등[2]에 의해 보고되었다.
Conidiomata: 병자각은 25°C 이상의 배지 상에서 잘 형성되고, 하나의 독립된 병자각으로 존재한다. 원형 또는 약간 타원형으로 일정한 형태를 가지며, 갈색 또는 어두운 갈색을 띠고, 균사에 덮여 있지 않다. 크기는 149~256 µm×176~287 µm이다.
Conidia: 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지고 있으며, 투명하고 격벽을 가지고 있지 않다. 크기는 3~4.5 µm×2~3 µm이다.
Culture characterisitics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 79 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하며, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여있다. 콜로니 색은 올리브색에서 어두운 올리브색이다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 76 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여있고, 밝은 녹색이다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 73 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며, 밝은 올리브색에서 어두운 올리브색을 띤다. 생장률은 25°C, PDA 배지에서 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 제주도 제주시, 토양, 2016년 3월 22일 채집, NNIBRFG1139, 국립낙동강생물자원관
Fig. 3. Colony shape and conidia and growth rate of Didymella ellipsoidea NNIBRFG1139. A, colony shape on potato dextrose agar (PDA); B, colony shape on malt extract agar (MEA); C, colony shape on oatmeal agar (OA); D, colony shape on potato carrot agar (PCA); E, colony shape on corn meal agar (CMA); F, colony shape on Czapeck-dox solution agar (CDA); G, colony shape on Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18) agar; H, colony shape on yeast extract peptone dextrose agar (YPDA); I, pycnidia on PDA plate, ×80; J, conidia on PDA at 25°C, ×400; K, growth rate (scale bars: I = 500 µm, J = 10 µm).
Didymella aeria Q. Chen, Crous & L. Cai. Figs. 1 and 4
D. aeria는 공기 중에서 분리된 종으로 Chen 등[2]에 의해 보고되었다.
Conidiomata: 병자각은 독립되어 있거나 여러 개가 결합된 형태이며, 원형 또는 약간 타원형의 모양이지만 형태가 일정하지 않고, 어두운 갈색이며, 균사체에 덮여 있다. 크기는 100~134 µm×104~145 µm이다.
Conidia: 타원형이고, 부드럽고 얇은 외벽을 가지며, 포자색은 투명하고, 격벽이 없다. 크기는 3~5 µm×2~3 µm이다.
Culture characteristics: PDA 상에서는 25°C에서 10일 동안 61 mm로 생장하고, 가장자리가 일정하다. 콜로니는 중심에서부터 방사형으로 갈라지고, 균사체가 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며 콜로니색은 녹색에서 회녹색을 띤다. MEA 상에서는 25°C에서 10일 동안 66 mm로 생장하고, 가장자리는 일정하다. 균사체가 수북하게 밀집된 형태이며, 콜로니는 녹색에서 어두운 녹색을 띤다. OA 상에서는 25°C에서 10일 동안 60 mm로 생장하고, 가장자리는 일정하다. 콜로니 중심에서부터 방사형으로 갈라지고, 균사체는 수북하게 밀집된 형태로 덮여 있으며, 백녹색에서 밝은 녹색을 띤다. 온도 및 배지별 생장을 조사한 결과, 20°C 또는 25°C에서 생장이 좋았으며, PCA 배지에서 생장률이 가장 높았다.
Specimen examined: 대한민국 경상북도 김천시, 토양, 2016년 3월 23일 채집, NNIBRFG-1480, 국립낙동강생물자원관
Fig. 4. Colony shape and conidia and growth rate of Didymella aeria NNIBRFG1480. A, colony shape on potato dextrose agar (PDA); B, colony shape on malt extract agar (MEA); C, colony shape on oatmeal agar (OA); D, colony shape on potato carrot agar (PCA); E, colony shape on corn meal agar (CMA); F, colony shape on Czapeck-dox solution agar (CDA); G, colony shape on Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18) agar; H, colony shape on yeast extract peptone dextrose agar (YPDA); I, pycnidia on PDA plate, ×80 & ×25; J, conidia on PDA at 25°C, ×400; K, growth rate (scale bars: I = 500 µm, J = 10 µm).
