서론
지금까지의 효모는 주로 술과 누룩 등의 발효제나 된장, 메주 등 전통 발효식품의 주, 부원료로부터 분리, 보고[1] 되었으나, 최근 필자 등은 우리나라 자연환경에 존재하는 야생효모의 종 분포 특성을 조사하고 이들로부터 산업적 유용 효모를 선별하고자 한라산, 덕유산 등의 우리나라 주요 산과 제주도, 울릉도 등의 섬 및 도시와 농촌 등지의 야생화와 토양 및 각종 부식물 등으로부터 약 1,600여 종의 야생효모를 분리하고 동정하여 보고하였다. 또한 이들 중 비병원성 효모에 대하여 대체의약 소재 개발을 위한 생리활성 우수 효모를 선발하여 보고하였고 아직까지 국내에서 보고되지 않은 미기록/신종으로 87균주의 야생효모를 선별한 후 이들의 미생물학적 특징을 보고하였다[2-16].
이와 같이 자연계에서 분리된 다양한 야생효모는 지역 간의 기후 등의 차이로 인한 야생화와 토양 등의 시료 간에 독특한 종 분포 특성이 있었고 토양에서도 산림지역, 논이나 밭 토양 간에 물성이나 부식물 함양 등의 차이로 인한 야생효모의 분포 특성이 다를 것으로 추정되었다. 따라서 재배 작물간의 야생효모 분포 특성을 알아보기 위해 전보[17]에서는 일반 농작물과는 다른 독특한 환경의 인삼과 당귀 등의 약용식물 재배지의 토양 등의 효모 종 분포 특성을 조사한 결과 인삼밭 토양에서는 Rhodotorula glutinis 가 가장 많이 분리되었고 당귀밭에서는 Cyberlindnera satumus 야생효모가 많이 분리, 동정되었다.
본 연구는 독특한 향미 성분을 함유한 향신료의 재배지에서 분리한 야생효모 중 국내 미기록 효모를 선별하여 이들의 균학적 특성을 조사하고 이들로부터 건강 소재 개발을 위한 산업적 자료를 얻기 위하여 실시되었다. 이를 위해 먼저 오랫동안 향신료를 재배해 오고 있는 충남 금산의 마늘 등의 4가지 향신료 재배지의 토양 등으로부터 분리한 야생효모 중 5종의 국내에 보고되지 않은 야생효모를 선별하여 이들의 균학적 특성을 조사하였다. 또한 이들의 무세포 추출물을 제조한 후 주요 생리활성으로 항치매성 acetylcholinesterase와 butyrylcholinesterase 저해활성과 미백성 tyrosinase 저해활성 등을 측정하였다
재료 및 방법
국내 미기록 효모의 선별 및 균학적 특성
필자 등이 충남 금산의 양파와 도라지, 마늘과 생강 등의 재배지 토양 시료에서 분리, 동정한 126종의 야생효모를 대상으로 국립 생물자원관 DB와 한국 진균 관련 학술자료를 이용하여 국내 미기록 효모를 선별한 후 일반 미생물 실험방법 등을 이용하여 이들의 몇 가지 균학적 특성 등을 조사하였다[9, 11].
야생효모의 생리활성 측정
무세포 추출물 제조: 국내 미기록 야생효모를 yeast extract peptone dextrose (YPD) 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 8,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 세포 배양물을 얻었다. 세포 배양물은 다시 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.3)에 현탁시킨 후 초음파 균체파쇄기(Vibra cell; SONICS & Materials, Newtown, CT, USA)로 파쇄하고 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 무세포 추출물을 얻었다. 무세포 추출물을 동결건조시킨 후 이를 0.1M sodium phosphate 완충용액(pH 7.3)에 10 mg/mL로 용해시켜 생리활성 측정용 시료로 사용하였다[8].
야생효모의 생리활성 측정: 항치매성 Acetylcholinesterase (AChE) 저해활성은 각 well plate에 0.1 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.3) 110 μL, acetylcholinesterase (0.8 unit/mL) 30 μL, 기질(2 mM acetylthiocholine chloride) 30 μL, 2 mM DTNB 20 μL, assay buffer에 1 mg/mL로 용해시킨 sample 10 μL를 혼합하여 37℃에서 6분 동안 반응시킨 후 A VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 415 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래와 같이 AChE 저해활성을 계산하였다[7, 18].
Acetylcholinesterase / Butyrylcholinesterase 저해활성(%) =
(C, 대조구의 흡광도; S, 시료구의 흡광도)
Butyrylcholinesterase (BChE) 저해활성은 무세포 추출물 50 µL 0.1 M sodium phosphate 완충용액(pH 7.3) 70 µL, BChE (0.8 unit/mL) 30 µL, DTNB (2 mM) 20 µL를 혼합한 후 2 mM acetylcholine chloride 30 µL을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하여 위와 같은 AChE 저해활성 측정식으로 BChE 저해활성을 계산하였다.
미백성 Tyrosinase 저해활성은 위와 같이 제조한 야생효모 무세포 추출물 시료 25 μL에 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8) 150 μL, 1.5 mM L-tyrosinase 50 μL 혼합 후 37℃에서 ELISA reader를 이용하여 5분간 incubation한 후 tyrosinase 40 U을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켜 470 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래와 같은 식으로 tyrosinase 저해활성을 계산하였다[17].
Tyrosinase 저해활성(%) = [ {C − (T − B) }/C] ⅹ 100
(C, 대조구의 흡광도; T, 시료구의 흡광도; B, 시료구 blank의 흡광도)
결과 및 고찰
마늘과 생강 재배지 토양으로부터 분리한 국내 미기록 야생효모의 특성
마늘과 생강, 양파와 도라지 등으로부터 분리한 야생효모 중 마늘과 생강 재배지 토양에서 분리한 Vishniacozyma peneaus I2-9 (NIBRFGC000502617), Cryptococcus aspenensis I21-1 (NIBRFGC000502616), Piskurozyma taiwanensis R4-1 (NIBRFGC000502619), Nadsonia starkeyi-henricii R6-2 (NIBRFGC000502618), Canadida friedrichii M12-6 (NIBRFGC000502615) 등 5균주가 국내 미기록 효모로 최종 선별되었다.
이들의 형태적, 배양적 특징과 phylogentic tree는 각각 Table 1, Fig. 1과 같다. 이들 미기록 효모는 구형~타원형으로 출아에 의해 영양 증식을 하였고 Vishniacozyma peneaus I2-9, Cryptococcus aspenensis I21-1, Piskurozyma taiwanensis R4-1, Nadsonia starkeyi-henricii R6-2은 자낭포자를 형성하였다.
Vishniacozyma peneaus I2-9, Cryptococcus aspenensis I21-1, Piskurozyma taiwanensis R4-1, Nadsonia starkeyi-henricii R6-2는 YPD 배지와 yeast extract–malt extracts (YM) 배지, 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서도 모두 생육하였으며 Vishniacozyma peneaus I2-9 외 4균주 모두 10% NaCl을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 호염성 효모로서 이들은 야생효모의 내염기작을 밝히는 학술적 연구 뿐만 아니라 내염성 효소 생산 등 산업적으로도 매우 유용한 대사산물을 생산할 것으로 추정되어 이들의 추가 연구가 요구된다.
국내 미기록 효모에 대한 외국 학술지 보고로 Vishniacozyma peneaus 는 Liu 등[19]에 의하여 Tremellomycetes의 분자계통학적으로 재동정 되었고, Cryptococcus aspenensis 는 태국의 사탕수수 잎에서 처음 분리, 동정되었다[20]. 또한 Piskurozyma taiwanensis 는 대만의 식물 잎에서 ballistocconidium을 형성하는 새로운 야생효모로 분리, 보고[21] 되었고, Nadsonia starkeyi-henricii 는 Kurtzman 등[22]에 의하여 Saccharomycotina와 같은 그룹에 속하는 새로운 효모 균주로 보고되었다.
또한, Canadida friedrichii 는 태국에서 분리, 보고된 Candida jarooni 및 Candida songkhlaensis 와 밀접하게 관련된 새로운 효모로 처음 보고[23] 되었다.
국내 미기록 야생효모의 생리활성
항치매활성과 미백활성을 가진 건강 소재를 생성하는 야생효모를 선별하기 위하여 위와 같이 선별한 미기록 야생효모의 무세포 추출물을 제조하여 항치매성 actylcholinesterase와 butyrylcholinesterase 저해활성과 미백성 tyrosinase 저해활성을 측정하였다(Table 2). 5주의 미기록 야생효모의 무세포 추출물 중 actylcholinesterase와 butyrylcholinesterase 저해활성은 Vishniacozyma peneaus I2-9가 각각 9.9%와 6.7%를 보였을 뿐 대부분 활성이 없거나 5% 미만을 보였다.
미백성 tyrosinase 저해활성은 Canadida friedrichii M12-6의 무세포 추출물이 14.4%로 제일 높았고 Nadsonia starkeyi-henricii R6-2가 5.5%를 보였으나 전보[17]의 인삼밭 토양에서 분리한 야생효모 Naganishia globosa G1-7의 28%와 Han 등[24]의 Starmerella bombicola 80-J-1의 저해활성(36.2%)보다는 낮은 활성이었다.
적요
생리기능성을 조사하기 위하여 먼저 충남 금산의 양파와 도라지, 마늘과 생강 등의 재배지 토양시료에서 분리, 동정한 야생효모 중 마늘 재배지에서 분리한 Piskurozyma taiwanensis R4-1 (NIBRFGC000502619), Nadsonia starkeyi-henricii R6-2 (NIBRFGC000502618), Canadida friedrichii M12-6 (NIBRFGC000502615) 균주와 생강에서 분리한 Vishniacozyma peneaus I2-9 (NIBRFGC000502617)와 Cryptococcus aspenensis I21-1 (NIBRFGC000502616) 균주의 야생효모를 국내 미기록 효모 균주로 최종 선별하여 이들의 형태학적, 배양학적 특성 등을 조사하였다. 미기록 균주들은 구형~타원형으로 Piskurozyma taiwanensis R4-1, Nadsonia starkeyi-henricii R6-2들은 자낭포자를 형성하였다. Vishniacozyma peneaus I2-9, Cryptococcus aspenensis I21-1, Piskurozyma taiwanensis R4-1, Nadsonia starkeyi-henricii R6-2는 yeast extract–peptone–dextrose (YPD) 배지와 yeast extract–malt extracts (YM) 배지, 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서도 모두 생육하였으며 Vishniacozyma peneaus I2-9 외 4균주 모두 10% NaCl을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 호염성 효모였다.
