Taxonomy
Filosporella 속은 수생균류로서 자낭균문에 속하나 과, 목, 강 등의 하위 분류체계는 정해지지 않았으며, 1976년 Nawawi에 의해 처음으로 보고된 이래 침전식물체에서 분리된 F. aquatica Nawawi, F. fistucella Marvanová & Fisher, F. versimorpha Marvanová, F. exilis Gulis & Marvanová, 담수포말에서 분리된 F. annelidica Crane & Shearer, F. pinguis Marvanová & Bärl을 포함하여 총 6종이 보고되었다. [1-7]
Bachine 등[8]은 수생균류의 분자생물학을 기반으로 하는 분류체계를 연구하였으며, Filosporella 중 F. exilis, F. fistucella, F. versimorpha는 Ascocoryne-Hydrocina clade에 속하고, F. cf. annelidica는 Cudonella-Hymenoscyphus clade에 속하는 다분류체계를 가지는 것으로 보고하였다.
6종에 대한 보고 및 분류체계에 대한 논문을 제외하고는 Filosporella에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으며, 국내에서는 Filosporella 속의 존재여부조차 보고된 바가 없다. 본 논문에서는 Filosporella속의 3종인 F. exilis, F. fistucella, F. annelidica의 분자계통학적 위치 및 형태학적 특징을 비교 분석하여 국내 미기록종으로 보고하고자 한다.
담수환경에 서식하는 곰팡이를 분리하기 위해, 제주 남생이못, 충북 보은군 보청천에서 토양, 수변식물 및 침전식물체 시료를 채집하였다. 토양시료는 하천의 바닥에 퇴적된 하천토를 채집하였으며, 담수침전식물체는 하천에서 부식된 식물잎을 폴리에틸렌 봉투에 담아서 채집하였다. 시료는 수분이 있는 상태에서 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 토양시료는 희석평판도말법을 이용하여 처리하였고, 채집한 수변식물의 뿌리에서 내생균류를 분리하기 위하여 뿌리의 외부를 Tween80과 1% 차아산염소나트륨(NaOCl)을 이용하여 표면소독 하였다. 세척한 뿌리를 1 cm 길이로 잘라 Hagem Media (HM; H2O, KH2PO4, NH4Cl, MgSO4·7H2O, C6H12O6, malt extract, FeCl3)에 올려 25℃에서 일주일간 배양하였다. 자른 뿌리의 단면에 균사가 나타나면 순수분리를 위하여 HM 배지에 계대배양하였다. 담수식물침전체는 세척한 후 여과된 현장수를 첨가하여 20℃에서 7일간 배양하였다. 배양액 100 μl를 WA(water agar: 20 g/L agar, 1 L distilled water, streptomycin100 ppm)배지에 도말한 후 15℃에서 배양하며 단포자 분리하였다. 순수분리된 균류는 PDA (potato dextrose agar; Difco; BD, Franklin Lakes, NJ, USA)배지에 접종하고 20℃에 배양하였고, 15% 글리세롤에 담은 후 -80℃에 저장하였다.
환경조건에 따른 생장률을 조사하기 위해 5℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 45℃의 7개 온도 범위와 PDA, malt extract agar (MEA), oatmeal agar (OA; Difco) 등 8가지 배지 종류를 실험에 사용하였다. 5일 동안 균사생장을 측정하였고, 3반복으로 실시하였다. 실험에 사용한 배지는 PDA, MEA (malt extract 2%; agar 2%/1 L), OA, Czapeck-dox solution agar (CDA; Difco), corn meal agar (CMA; Difco), yeast extract peptone dextrose agar (YPDA; Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands), Dichloran glycerol chloramphenicol (DG18; Merck Millipore, Billerica, MA, USA), potato carrot agar (PCA; HiMedia, Mumbai, India)이다.
포자생성을 조사하기 위해 멸균된 액체 배지(0.1 g CaCl2·2H2O, 10 mg MgSO4·7H2O, 10 mg KNO3, 0.55 mg K2HPO4, 0.5 g MOPS buffer, 1 L distilled water)에 agar조각을 접종한 후 20℃에서 50 rpm으로 배양하면서 생성된 포자를 현미경으로 관찰하였다.[9]
분자계통학적 연구를 위해서 PDA에 배양한 균사체를 수확하여 glass bead가 담긴 tube에 넣고 균질화시킨 후 Nucleospin Plant II DNA extraction Kit (Macherey-Nagel, Düren, German)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 ITS1 및 ITS4 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다[10]. DNA 염기서열 정렬 및 편집, 계통수 작성을 위해 MEGA 7.0.26을 사용하였다[11].
Filosporella exilis Gulis & Marvanová, Mycotaxon 68: 313 (1998) [4] [Figs. 1&2]
MycoBank No.: MB444879
Filosporella exilis는 잘 알려진 수생균류로서, Gulis & Marvanová에 의해 담수침전식물체에서 분리되었음이 보고되었다. 유성세대는 알려져 있지 않으며, 연구가 거의 이루어지지 않았다. NNIBRFG1552균주는 제주 남생이못의 담수퇴적토에서 분리되었다. 이 균주의 ITS rDNA 영역의 염기서열을 NCBI에 등록된 염기서열과 비교하여 분석한 결과, F. exilis (KC834046)와 100%의 상동성을 보였으며, 계통수(Fig. 1)에서 F. exilis와 동일한 Ascocoryne-Hycrocina clade에 속하는 것 을 확인하였다.
NNIBRFG1552 균주는 PDA상에서 배양했을 때 20℃에서 1.6 mm/day의 생장률로 아주 느리게 자라며, PCA상 25℃에서 2.0 mm/day으로 생장율이 가장 높았고, 30℃ 이상에서는 거의 생장하지 못했으며, 대부분의 배지에서 주황색으로 배지색을 변화시키는 것을 관찰하였다. 콜로니의 앞은 가운데 부분이 진한 주황색을 띄다가 가장자리는 연한 회색을 띄었다. 콜로니의 뒷 부분은 가운데는 어두운 갈색을 띄다가 가장자리는 연한 주황색을 띄었으며, 균사체의 밀도가 높고 중앙이 볼록 융기된 형태로 중앙에서 가장자리로 갈라짐을 보이며 가장자리는 대체로 둥근형태이다.
NNIBRFG1552 균주의 균사는 투명하였으며, 수중에서 배양했을 때 포자를 형성하였으나 분생자경은 관찰하지 못했다. 소형분생포자는 긴 타원형 또는 주로 원통형의 막대모양으로 2~3개의 격벽을 이루고 있으며, 크기는 6~20 μm x 1.5~2μm 이다. 주로 길이가 짧은 분생포자를 생성하며, 본 연구에서는 다른 형태의 포자는 관찰하지 못했다.
Habitat: Soil in pond
Specimen examined: Namsaengi-mot, Jeju, Korea, 22 Mar 2016, NNIBRFG1552, Nakdonggang National Institute of Biological Resources
Filosporella fistucella Marvanová & Fisher, Nova Hedwigia 52 (1-2): 33 (1991) [2] [Figs. 1&3]
MycoBank No.: MB130194
Fig. 1. Phylogenetic tree inferred using Neighbor-Joining method of an alignment of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS rDNA) sequences of three Filosporella species including F. exilis, F. fistucella and F. annelidica (in red colour). Alatospora flagellata and A. pulchella were used as an outgroup. The optimal tree with the sum of branch length = 0.66981201 is shown. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches.
Filosporella fistucella는 내생균류로서, Marvanová & Fisher에 의해 검은오리나무(Alnus glutinosa) 뿌리의 껍질에서 최초 보고되었다. 유성세대는 알려져 있지 않으며, 연구가 거의 이루어지지 않았다. NNIBRFG3013균주는 제주 남생이못의 수변식물인 어리연꽃(Nymphoides indica)에서 분리되었다. 이 균주의 ITS rDNA 영역의 염기서열을 NCBI GenBank 염기서열과 비교하여 분석한 결과, F. fistucella (KC834047)와 99.8%의 상동성을 보였으며, 계통수(Fig. 1)에서 F. fistucella와 동일한 Ascocoryne-Hycrocina clade에 속하는 것을 확인하였다.
NNIBRFG3013 균주는 PDA상에서 배양했을 때 20℃에서 1.7 mm/day의 생장률로 아주 느리게 자라며, CDA상 20℃에서 2.2 mm/day으로 생장율이 가장 높았고, 30℃ 이상에서는 거의 생장하지 못했다. 콜로니의 앞은 연한 회색을 띄었고, 콜로니의 뒷 부분은 가운데는 짙은 회색을 띄다가 가장자리는 흰색을 띄었으며, 균사체의 밀도가 높고 가장자리는 둥근형태이다.
NNIBRFG3013 균주의 균사는 투명하였으며, 수중에서 배양했을 때 포자를 형성하였으나 소형분생포자의 분생자경만 관찰하였다. 소형분생포자경은 대형분생포자의 끝부분 또는 중간부분에서 생성되었으며, 소형분생포자는 원통형으로 크기는 3 μm정도이다. 대형분생포자는 주로 가늘고 긴 원통형의 막대모양으로 9~19개의 격벽을 이루고 있으며, 길이는 최대 120 μm, 폭은 1.5~2 μm 정도이다.
F. fistucella 와 F. exilis는 분자계통학적 위치 및 막대모양의 포자형태가 비슷하였으나, 배지상에서의 콜로니의 형태와 생장 온도 등에서 다른 양상을 보였으며, 포자생성에서도 F. exilis는 배지에 색소를 띄고, 소형포자를 주로 생성하였으나, F. fistucella는 배지에 색소를 띄지 않고, 대형포자를 주로 생성하는 등 차이를 보였다.
Habitat: endophyte in Nymphoides indica from edge of the pond
Specimen examined: Namsaengi-mot, Jeju, Korea, 9 Aug 2016, NNIBRFG3013, Nakdonggang National Institute of Biological Resources
Fig. 3. Colony shape, growth rate and conidia of Filosporella fistucella NNIBRFG3013. A & B: colony of PDA at 20℃ on 7 days(A) & 15 days(B), C: growth rate on eight media and seven temperature, D: microconidia (yellow arrow head conidiophore, red arrow head microconidia), E-J: macroconidia captured under a light microscope (x400, size bars 10μm).
Filosporella annelidica Shearer & J.L. Crane, Mycotaxon 6(1): 28 (1977) [6] [Figs. 1&4]
MycoBank No.: 314134
Synonym: Rogersia annelidica Shearer & J.L. Crane, Mycologia 68(4): 949 (1776) [5]
Filosporella annelidica는 Sheare & Crane에 의해서 처음 Rogersia annelidica로 보고되었으나, F. aquatica와의 형태적 유사성을 고려하여 F. annelidica로 재명명되었다. 유성세대는 알려져 있지 않으며, 연구가 거의 이루어지지 않았다.
NNIBRFG5472 균주는 충북 보은 보청천의 담수침전식물체에서 분리되었다. 이 균주의 ITS rDNA 영역의 염기서열을 NCBI에 등록된 염기서열과 비교하여 분석한 결과, F. cf. annelidica (KC834044)와 일치하였고, 계통수(Fig.1)에서도 F. cf. annelidica와 동일한 Cudoniella- Hymenoscyphus clade에 속하는 것을 확인하였다.
NNIBRFG5472 균주는 PDA상에서 배양했을 때 20℃에서 1.1 mm/day의 생장률로 아주 느리게 자라며, OA상 20℃에서 1.5 mm/day으로 생장율이 가장 높았고, 30℃ 이상에서는 거의 생장하지못했다. 콜로니의 앞은 연한 회색을 띄었고, 콜로니의 뒷 부분은 가운데는 짙은 회색을 띄다가 가장자리는 흰색을 띄었다. 균사체의 밀도가 높고 중앙이 볼록 융기되며 중앙에서 가장자리로 갈라짐을 보이고, 가장자리는 대체로 둥근형태이다.
NNIBRFG5472 균주의 균사는 투명하였으며, 수중에서 배양했을 때 포자를 형성하였다. 분생자경은 균사의 끝부분 또는 중간부분에서 관찰되었다. 분생포자는 약간 휜 활모양으로 투명하고, 7~10개의 격벽을 가지며, 길고 얇은 원통형으로 끝으로 갈수록 좁아졌다. 크기는 180~220 μm x 3.5~5 μm, 끝은 1.5~2.5 μm (width) 정도이다. NNIBRFG5472 균주와 F. annelidica의 기준 균주가 비슷한 형태를 보였다. NCBI 상에 등록된 염기서열과 분석했을 때 F. cf. annelidica와 일치하였고, 형태적인 특징을 토대로 F. annelidica로 동정할 수 있을 것으로 판단된다.
F. annelidica는 형태적 및 분자계통학적인 면에서 Filosporella 속의 종들과 다른 양상을 보였다.
분자계통학적인 측면에서는 F. exilis, F. fistucella 등과 다른 clade에 속하며, 포자의 형태에 있어서도 소형과 대형포자를 따로 구분해서 생성하지 않았으며, 포자의 크기가 크고 구부러진 활모양으로 원통형의 막대모양인 다른 종들과 차이가 있었다.
Habitat: plant litter in stream
Specimen examined: Bocheong-cheon, Boen-gun, Chungcheongbuk-do, Korea, 9 Mar 2018, NNIBRFG5472, Nakdonggang National Institute of Biological Resources
Fig. 4. Colony shape, growth rate and conidia of Filosporella annelidica NNIBRFG5472. A & B: colony of PDA at 20℃ on 7 days (A) & 30 days (B), C: growth rate on eight media and seven temperature, D: conidia and conidiophore (yellow arrow head conidiophore), E: conidia captured under a light microscope (x400, size bars 10 μm).
적요
담수생태계에 서식하는 균류의 다양성을 조사하기 위해 연못과 하천에서 담수퇴적토, 수변식물, 담수침전식물체를 채집하였다. NNIBRFG1552와 NNIBRFG3013은 2016년 제주 남생이못에서 채집한 담수퇴적토와 수변식물에서 각각 분리되었고, NNIBRFG5472는 2018년 충북 보은의 보 청천에서 채집한 담수침전식물체에서 분리되었다. 이들 3균주의 형태적 및 분자계통학적 특징을 바탕으로 동정한 결과 NNIBRFG1552, NNIBRFG3013, NNIBRFG5472는 각각 Filoporella exilis (100%, KC834046), F. fistucella (99.8%, KC834047), F. cf. annelidica (100%, KC834044)로 확인되었다. 또한, 이들 3개 균주의 배양 및 형태학적 특성이 분자계통학적 분류와 일치되는 것을 확인하였다. Filosporella 속은 국내에서는 보고된 바 없으며 본 보고가 국내 최초이다.
