서론
국내에는 총 13,200여 종의 식물이 자생하고 이 중 관속식물류는 9,699종으로 국내에 존재하는 대부분의 식물이 포함된다[1]. 2013년에 발간된 ‘우리산에 자라는 약용식물’을 보면 국내 자생종과 일부 귀화식물 중에서 2,200여 종이 약용으로 이용 가능한데 이 중 흔히 535종이 약초로 사용된다고 서술되었다[2]. 대부분의 약용식물은 각혈, 관절염, 당뇨, 변비, 치질, 타박상 등 다양한 곳의 치료 목적으로 사용되었다. 이러한 약용식물의 가치에 따라 전국에서 채집한 국내 자생종과 귀화식물인 약초를 보존하고 증식시키는 연구를 하는 곳의 하나로 전남 장흥군에 위치한 약초연구소 가 있다. 약용 식물의 보존을 위해서 필요한 중요 연구 하나는 병해충으로부터의 보호이다. 이곳에 존재하는 약용식물의 생육 상을 둘러보면서 잎에 이상이 있는 시료를 채집하였다. 채집한 시료는 부처손(Selaginella tamariscina Buayv.), 산비장이(Serratula coronata L. ssp. insularis (Iljin) Kitam.), 황금(Scutellaria baicalensis George), 현삼(Scrophularia buergeriana Miq.)이었다.
시료의 채집은 2018년 4월, 대전광역시 유성구 구성동 인근(N36°37'44", E127°36'74")에서 진행되었다. 선류(moss)에 속하는 표주박이끼(Funaria hygrometrica)를 채집하여 48시간 이내에 실험실로 운반하였다. 헛뿌리는 증류수로 씻어 흙을 완전히 제거한 후에 75% EtOH에 1분, 2% NaClO 용액에 3분, 75% EtOH에 0.5분간 차례로 처리하여 표면 살균하였고, 100 μg/mL 농도의 streptomycin 용액에 10분간 처리한 뒤 멸균수로 3회 씻어주었다[10]. 표면 살균된 뿌리는 filter paper를 이용하여 물기를 완전히 제거한 뒤 0.5 cm 길이로 잘라 water agar (WA) 배지의 네 귀퉁이에 치상하였다[11]. 25ﾟC의 암소에서 배양하면서 매일 관찰하여 균사가 뻗어 나오는 것이 확인되면 살균된 메스를 이용하여 potato dextrose agar (PDA) 배지로 계대 배양하였으며, 순수 분리된 균주는 PDA배지와 더불어 malt extract agar (MEA)배지에서 7일간 배양하여 해부현미경 및 광학현미경 상에서 형태적 특성을 관찰하였다(Table 1). 형태적으로 분류된 균주의 동정을 위해 DNeasy plant mini kit(Qiagen, USA)의 protocol에 따라 균사에서 DNA를 추출한 뒤, ribosomal DNA의 5.8S 지역을 포함하는 internal transcribed spacer (ITS)영역을 균류 특이적 primer인 ITS1F와 ITS4 [12]를 이용하여 증폭하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 rDNA의 large subunit (LSU)영역을 primer LR0R과 LR16[13]을 이용하여 증폭하였다. PCR반응의 annealing 단계에서 ITS 영역은 50°C, LSU 영역은 44°C로 설정하였다. PCR이 끝난 후 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에 20분간 loading하여 각각 DNA단편의 크기를 확인한 후 SolGent (Daejeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. DNA 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) 상에서 BLAST 프로그램으로 GenBank database에 존재하는 유사한 염기서열을 가진 종을 찾고 유사도를 확인하였다. 계통분석은 MEGA7 프로그램을 이용하여[14] neighbor-joining 방식으로 계통도를 작성하였다. 확인된 미기록종 균주는 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하였으며, BLAST 및 계통도 작성에 이용된 염기서열은 NCBI에 등록하였다.
부처손은 부처손목 부처손과에 속하는 양치식물로 산지 바위지대나 절벽 주변에서 서식하는 상록성 여러해살이풀이다. 주로 관상용으로 심으며, 수렴작용, 지혈작용이 있는 약용식물로 알려져 있다[3]. 외상성 출혈, 폐 질환의 조혈, 위장관 출혈, 조혈, 분만 후 분비물 배출, 직장 탈출증 및 백혈구의 치료 등에[4]. 부처손 추출물은 리파아제 저해활성 및 지질 축적을 억제하는 효과가 있으며[5], 실내공간에서 포름알데하이드를 제거하는 능력이 있어 공기정화식물로도 알려져 있다[6]. 산비장이는 햇볕이 잘 드는 산지의 숲 가장자리 경사지대나 들녘 등에 자라는 여러해살이 풀이다. 산비장이는 우리나라 전역과 일본에서 서식하는 식물로 어린순을 식용할 수 있다[1]. 산비장이 추출물에서는 식물스테로이드인 3-epi-20-hydroxyecdysone가 존재한다고 보고되었다[7]. 황금은 중국 원산의 귀화식물로, 우리나라의 북부지방에서 주로 자생하며 러시아, 몽골, 일본 등 아시아에 주로 분포하는 식물이다. 중국 약초에 일반적으로 사용되는 것으로 2,000년 이상 의학적으로 사용되어 왔는데 뿌리는 장염, 이질, 설사, 황달, 만성 간염, 요로 감염, 고혈압, 유산 위험, 코피 및 폐 또는 장의 출혈 치료에 사용되어 왔다[3]. 최근 연구에 따르면 뿌리에는 간 기능을 크 게 향상시키고 항 염증 및 항 알레르기 효과가 있는 플라보노이드가 포함되어 있다. 씨앗은 혈액과 고름의 장을 정화하는 데 사용된다고 한다. 따라서 약용 및 관상식물로서 가치가 높은 생물자원이다[1,8]. 현삼은 산과 들의 습한 곳에서 자생하는 여러해살이의 약용식물이다. 우리나라는 강 원도 이북에 자생하며, 남한에서는 약용으로 재배하고 일본, 중국, 러시아 등에 분포한다[1]. 뿌리는 항염증제, 해열제, 저혈당증, 저혈압 및 혈관 확장제로 이용되는데 한국에서는 홍반, 갑상선종 및 가래의 치료에 사용되며, 2014년에 뿌리에서 새로운 이리도이드(iridoid)를 생성한다고 보고되 었다[3, 9].
본 연구에서는 이와 같은 특성을 지닌 자생식물의 병리학적 연구를 위해 잎에 이상이 있어 보여 채집된 약용식물 잎 조직으로 분리된 국내 미기록 진균 4종에 대하여 형태적 및 분자생물학적 특성을 보고하고자 한다.
재료 및 방법
시료 채집 및 순수 분리
2018년 6월, 전라남도 장흥군에 위치한 약초재배사에 재배 중인 국내에서 자생하는 약용식물인 부처손, 산비장이, 황금, 현삼의 잎 시료를 각각 채집하였다(Fig. 1). 시료에서 병반처럼 보이는 부위를 중심으로 해부현미경(SZ61 stereo microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰 후, 식물 조직의 일부를 멸균된 면도날로 생물안전 작업대에서 1×1 cm 크기의 단편으로 절단하였다. 자른 절편시료는 5% 차아염소산나트륨 용액에 1분, 80% 에탄올에 30초, 멸균된 증류수에 1분 처리를 각각 한 후, 멸균된 필터페이퍼로 물기를 제거하고 3가지 항생제(암피실린, 스트렙토마이신, 카나마이신)가 200 mg/mL 농도로 첨가된 PDA에 올린 다음 25℃에서 3일에서 5일 동안 배양하면서 균사의 발생을 유도하였다[10,11].
Fig. 2. Colony morphology of the four unrecorded fungal species isolated in this study from medicinal plants in Korea. Cultures were grown on PDA at 25℃ for 7 days. A, Isolate DUCC5600 (Paraboeremia selaginellae ); B, Isolate DUCC5602 (Colletotrichum camelliae ); C, Isolate DUCC5602 (Alternaria eichhorniae); D, Isolate DUCC5603 (Phomopsis capsici)
잎에 존재한 병반에서 분리한 시료가 접종된 PDA 배지에서 자라나온 균사를 다시 항생제가 첨가된 PDA에 옮긴 후, 25℃ 배양기에서 배양하면서 세균 오염 없이 PDA 배양배지에서 생육하는 균을 순수 분리 하였다. 순수 분리가 된 균은 5% 디메틸 설폭시화물 (dimethyl sulfocide; DMSO, Duchefa Biochemie, Netherlands)를 함유하는 용액에 균이 자란 agar plugs (직경 5 mm) 를 5개씩 2ml cryrogenic vial 넣어 -80℃ 초저온냉동고에 저장하여 보관 균주로 저장하였다. 동정을 위한 실험 균주는 4℃ 냉장고에 보관하여 사용하였다.
형태학적 관찰 및 분자생물학적 동정
형태적 관찰을 위해서는 PDA에 순수 분리 후 배양된 진균의 포자와 균사 등 미세구조는 광학현미경(Axioskop40; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다. 배양배지에 나타난 균총의 형태는 육안으로 관찰하고 사진으로 촬영 기록하였다. 분자생물학적 동정을 위하여 드릴 추출 방법을 이용하여 균사의 세포벽을 파쇄한 후 Qiagen사의 Plant genomic DNA extraction kit를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다[12]. 추출한 DNA를 template로 하여 ITS rDNA region[13]과 28S rDNA region[14]을 Kim 등의 방법[12]에 따라 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 하였다. PCR로 증폭된 DNA 산물은 1% agarose gel에 전기영동을 수행하여 밴드의 크기를 각각 확인한 다음 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하 여 정제한 후 마크로젠사 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 유사 염기서열을 찾기 위해 미국 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 웹에 있는 BLAST 프로그램을 사용하여 DNA 데이터베이스에 등록되어 있는 진균들과 상동성을 비교하였다. 분자적 동정을 위해서 비교검색 결과 나타난 분석된 염기서열과 유사한 염기서열을 지닌 종들의 염기서열을 함께 다운 받아서 다중정렬을 실시하고 계통도 분석을 수행하였다. 계통수 분석은 MEGA 6 프로그램[15]을 이용하여 염기서열의 유사도와 함께 분석하였다. 구체적인 계통수 작성은 neighbor-joining 방법[16]을 사용하였고 계통수 가지의 clade 신뢰도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 분석하였다. 염기서열 유사도 분석과 계통수 분석에 사용된 비교 종의 염기서열은 GenBank에서 다운받아 사용하였고 Table 1과 Fig. 4에 등록번호와 함께 제시하였다. 동시에 본 연구에서 동정된 4종의 미기록종 진균 균주는 미래의 생물자원으로 활용하기 위해 국립생물자원관에 기탁하였다. 기탁번호는 Table 1에 제시하였다. 또한, 이들로부터 분석된 ITS 및 28S rDNA 염기서열 정보는 미국 NCBI의 DNA 데이터베이스인 GenBank에 등록하였고 등록번호는 Table 1에 제시하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서 균류 분리가 이루어진 부처손의 경우 식물체 전체가 녹색으로부터 갈색으로 변색되어 있었다(Fig. 1A). 전체적인 식물 색조 변화가 균류의 감염에 의한 것인지 여부는 확실하지 않았다. 잎의 중간 부위를 채집하여 분리된 진균 DUCC5600 균주를 PDA에 25℃ 조건에서 7일간 배양하였을 때 자라난 균총 사진은 Fig. 2A와 같다. 옅은 옥색을 띄는 색조로 균사가 생장하였으며 균총의 끝에 연한 노란색의 균사가 존재하였다. 균사의 퍼짐은 자라나면서 배지 위에서 명확하게 굴곡이 이루어지게 생장하였다. 기중으로 들리지는 않고 생장한 균사 끝 부분은 다소 솜털처럼 나타났다. 그리고 균사 끝은 방사상으로 퍼지는 균사의 생육 차이로 인하여 하나의 원처럼 둥글게 자라나지 못하고 부채꼴 모양으로 구획되는 양상을 보였다. 광학현미경으로 미세구조를 관찰하였을 때 타원형의 포자(3-4.5×1-2 ㎛)가 분생자경 끝에 존재하였다(Fig. 3A). 28S rDNA와 ITS region 염기서열을 분석한 결과 GenBank 데이터베이스에 등록된 P. selaginellae 종의 28S rDNA (GU238142)와 ITS (GU237762) 염기서열에 100% 상동성을 보였다(Table 1). 계통수 분석으로 유사 종과의 유전적 위치를 비교하였을 때 ITS 염기서열 기반 트리에서는 유사종 P. camelliae 와 같이 분류되었으나 28S rDNA 염기서열 기반 트리에서는 P. selaginellae와 함께 명확하게 묶이면서 다른 유사종으로부터 분리되는 결과를 보였다(Fig. 4). 28S rDNA 염기서열이 ITS 염기서열보다 진화유전적으로 더 안정된 관계를 보여주기 때문에 부처손에서 분리된 DUCC5600 균주를 P. selaginellae로 동정하였다. Paraboeremia 속은 Didymellaceae에 속했던 속으로 2015년 중국의 Chen에 의해 Phoma 속에서 새롭게 분류학적으로 분리 되었으며[17], 최근 국내에 자생하는 식물 칼란데 난(Calanthe orchid)종의 뿌리 근역에서 ITS 염기서열 기반 OTU 분석에서 우점하는 균속으로 보고된 바 있다[18]. 그러나 P. selaginellae 종은 아직 국내에 보고가 되어 있지 않아 미기록 종으로 판단하였다
Fig. 3. Light microscopic morphology of the four unrecorded fungal species isolated in this study from medicinal plants in Korea. A, Paraboeremia selaginellae ; B, Colletotrichum camelliae ; C, Alternaria eichhorniae; D, Phomopsis capsici . α= α spore, β= β spore, γ= γ spore. (Scale bars: A, B, C, E=10 ㎛, D=20 ㎛).
채집된 산비장이 시료는 검은색 반점이 존재하는 잎이었다(Fig. 1B). 이로부터 순수 분리된 DUCC5601 균주를 PDA에 25℃ 조건으로 7일간 배양하였을 때 자라난 균총 사진은 Fig. 2B와 같다. 전체적으로 아이보리색 균사가 만연하였고 중앙은 연한 핑크빛이 도는 색과 검은 색이 드문드문 산재한 식으로 나타났다. 균사는 빠르게 생장하였고 포자 형성이 잘 이루어지는 특징을 보였다. 광학현미경으로 미세구조를 관찰하였을 때 약 2-2.5×1.5-2 ㎛ 크기의 작은 타원형의 포자가 분자자경 끝에서 존재하였다. 분자적 동정을 위해 28S rDNA와 ITS region 염기서열을 분석한 결과 GenBank 데이터베이스에 등록된 Colletotrichum camelliae 종의 28S rDNA (MH875586)와 ITS (EU732732) 염기서열에 100% 상동성을 보였다(Table 1). 계통수 분석으로 유사 종과의 유전적 위치를 비교하였을 때 28S rDNA 염기서열과 ITS 염기서열 기반의 작성된 2개의 트리 모두 DUCC5602 다른 유사종과 명확히 분리되면서 C. camelliae 와 함께 clade를 형성하였다(Fig. 4). 형태적 특성을 살펴봤을 때 균총과 미세구조가 탄저병균의 특징을 보여주고 있고 분자적으로 종구분이 뚜렷하게 분지되는 바 산비장이 잎에서 분리된 DUCC5602 균주를 C. camelliae로 동정하였다. C. camelliae는 차나무(Camellia sinensis (L.) Kuntze)에서 처음 분리되었으며[19], 또한 차나무의 잎에 brown blight disease를 일으킨다고 보고되었다[20]. 최근 중국 연구자에 의해 동백나무(Camellia japonica L.)에서 유사한 종인 Colletotrichum camelliae-japanicum 이 신종으로 보고된바있다[21]. 국내에서도 차가 보성 등 여러 곳에서 재배되고 있지만 아직 이들 병원균에 의한 차나무 식물 피해나 균학적 연구는 보고되고 있지 않다. 다만 동백나무 탄저병으로 알려진 Glomerella cingulata의 경우 이종규 등의 수목병리학 책자[22]에 불완전세대로서 C. camelliae로 언급되어 있으며 또한 국가생물종 목록에도 이 종의 존재에 대해서 서술되어 있다[23]. 그러나 이들 서술에 대한 확증 균주가 존재하지 않으며 균학적 연구 보고가 없는 실정이다. 특히 국가생물종 목록과 관련하여 근거가 되는 자료는 1928년 일제시대에 조사된 Glomerella cingulata로서 2001년에서 2003년까지 국내에서 복숭아 탄저병의 주 원인균으로 조사하였으나 확인되지 않았다[24]. 더불어 이 균의 이명은 G. gossypii 으로 기록되어 있는데 주로 목화에 탄저병을 일으키는 것으로 알려 져 목화에서의 존재가 일제시대 때 확인된 것으로 보고되었다. 따라서 이 균의 불완전 세대가 다양하기 때문에 단순한 형태만으로 종을 구분하기 불가하다. C. camelliae는 1899년 처음 보고되었지만 type 균주가 존재하지 않고 자세한 균학적 특성 기술이 약해서 2015년에서야 신뢰할 수 있는 자세한 형태학적 특성과 유전자에 대한 균학적 특징이 epitype과 함께 제시되었고 현재 current name으로서 종의 위치를 차지하고 있다[25]. 이런 상황으로 볼 때 이 종에 대한 지금까지의 국내의 정보는 과학적 근거가 부재하여 기록종으로서 신뢰할 수 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서 분리된 균주를 국내 기록종 type 균주로 정하고 서술된 형태적 특징과 분자생물학적 특징을 국내에서 처음 보고하는 균학적인 정보로 활용할 것을 제안하고자 한다.
황금에서 채집된 잎 시료는 잎 끝이 탄 듯이 검은색으로 변색된 것이었다(Fig. 1C). 잎 끝 부분 부위에서 순수 분리된 DUCC5602 균주를 PDA에 25℃ 조건에서 7일간 배양하였을 때 자라난 균총 사진은 Fig. 2C와 같다. 균총은 중앙 부위를 중심으로 옅은 갈색과 와인색에 가까운 색을 나타내었다. 균사가 자란 균총의 끝 부분은 배경에 짙은 회색을 띠었고 균사가 동심적으로 자라난 형태를 보였다. 광학현미경으로 미세구조를 관찰하였을 때 분생포자는 전형적인 Alternaria 의 포자 형태로서 25-32×5-7 ㎛ 크기를 지니고 있었고 1개의 포자 내에 2~3개의 격벽이 존재하였다 (Fig. 3C). 분생포자는 분생자경 끝에서 분지되어 연쇄적으로 생성되었다. 포자의 끝에는 beak가존재하는 것도 있었고 없는 것도 있었다. 포자는 다소 거친 느낌의 두터운 갈색이나 암갈색을 띠었으며 세포벽은 두꺼운 형상을 보였다. 균총에서 유성세대는 볼 수 없었다. Alternaria 균류는 속 수준에서는 어느 정도 구분이 가능하나 종 수준에서는 구분이 쉽지 않으므로 28S rDNA와 ITS region 염기서열을 분석한 결과 GenBank 데이터베이스에 등록된 Alternaria eichhorniae 종의 28S rDNA (KP124579)와 ITS (MH397109) 염기서열에 100% 상동성을 보였다(Table 1). 계통수 분석으로 유사 종과의 유전적 위치를 비교하였을 때 ITS 염기서열 기반 트리와 28S rDNA 염기서열 기반 트리 모두에서 A. eichhorniae 와 함께 명확하게 묶이면서 다른 유사 종으로부터 분리되는 결과 를 보였다(Fig. 4). 이에 따라 형태적 특성과 분자적 동정 결과에 의거하여 황금 식물 잎에서 분리된 DUCC5602 균주를 A. eichhorniae 로 동정하였다. 이 종 또한 국내에서 균학적 연구 보고가 되어있지 않아 국내 미기록 종으로 판단하였다. 이 균은 원래 남아메리카가 원산지인 수생식물 부레옥잠(Eichhornia crassipes)에서 최초 발생 보고된 이후 인도, 방글라데시, 인도네이시아, 아프리카 등에서 발생이 보고되었다[26,27]. 이 균의 병리학적 특성으로는 식물 독소인 Alteichin을 분비하여 식물 기주를 공격한다[28]. 이런 mycoherbicidal 특성 때문에 A. eichhorniae 는 잡초를 제거하는 biological control agent의 역할을 하는 균으로 보고되었다[29,30]. 잡초 방제제로 사용하기 위해서 다양한 식물을 대상으로 병원성 시험을 한 결과 기주 특이적 특성을 가지고 있는 것으로 알려지 고 있다[27]. 따라서 본 연구에서 분리된 황금 식물이 기주인지 여부에 대한 정보는 매우 의미가 있을 것으로 사료된다. 향후 접종 실험을 통해 병원균인지의 여부에 대한 조사가 필요하다.
현삼에서 채집된 잎 시료는 잎에 검은 반점이 불규칙하게 여러 군데 존재하였고 잎 끝은 불마름 증상처럼 검게 변색된 것이었다(Fig. 1D). 잎 끝 부분 부위에서 순수 분리된 DUCC5603 균주를 PDA에 25℃ 조건에서 7일간 배양하였을 때 자라난 균총 사진은 Fig. 2D와 같다. 7일간 배양하였을 때 90 mm 배양배지를 가득 채우며 생장하였다. 회색의 균사가 자라면서 형성되기 시작한 균총은 점차 전체적으로 회색에 가까운 색을 나타내었고 균총의 끝 부분은 검은색을 띠었다. 점질물 생성은 관찰되지 않았다. 광학현미경으로 미세구조를 관찰하였을 때 특징적인 무색의 3종류 포자가 존재하였다. 타원형의 α 포자 (3-4.5×0.5₋1 ㎛)가 주를 이루었고 드물게 실핀처럼 가늘고 길게 늘어난 β포자 (14.5-16.0×0.5-1.0 ㎛)와 타원형에서 약간 늘어난 형태의 γ포자 (4.5₋5.5 × 0.5₋1.0 ㎛)가 존재하였다(Fig. 3D, 3E). 이런 다양한 포자 특성은 Phomopsis의 분생포자에서 알려져 있다[31]. 분자적 동정을 위해 ITS region 염기서열을 분석한 결과 GenBank 데이터베이스에 등록된 Phomopsis capsici 종의 ITS (MF574244) 염기서열에 100% 상동성을 보였다(Table 1). 계통수 분석으로 유사 종과의 유전적 위치를 비교하였을 때 ITS 염기서열 기반 트리에서 P. capsici와 함께 명확하게 묶이면서 다른 유사 종으로부터 분리되는 결과를 보였다(Fig. 4A). 이에 따라 형태적특성과 분자적 동정 결과에 의거하여 현삼 식물 잎에서 분리된 DUCC5603 균주를 P. capsici 로 동정하였다. 국내에 P. capsici 균류에 대한 연구 보고가 없는 바 미기록 종으로 판단하였다. P. capsici 균은 고추와 파프리카에 무름병을 일으키는 균으로 보고되었다[32]. 국내에서 고추 재배가 오랫동안 이루어져 왔지만 아직 이 균에 의한 피해는 보고되지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서 현 삼으로부터 분리된 균주가 현삼에 병을 일으키는지 여부와 더불어 고추에 병원성이 있을지는 향후 검토가 필요하다.
