서론
최근 건강과 아름다움을 동시에 추구하려는 사람들이 크게 증가함에 따라 주름생성 억제와 멜라닌의 피부 침착을 방지하는 미백 등 다양한 생리활성을 가진 기능성 화장품의 수요가 크게 증가하고 있고 따라서 이들에 관한 연구, 개발이 많이 실시되고 있다[1].
미백에 관련된 멜라닌 생성의 rate-limiting 효소인 tyrosinase (EC 1.14.18.1)는 L-tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)으로 전환시키고 L-DOPA를 DOPA quinone으로 변환하여 최종적으로 eumelanin과 pheomelanin 등의 멜라닌을 생합성 한다[1].
현재 미백 소재로 이용되고 있는 것들은 대부분이 tyrosinase 저해제들로 albutin과 kojic acid등이 많이 알려져 있는데 이들은 vitamin C와 함께 피부색을 밝게 하고 멜라닌 과잉 침착을 억제하는 효능이 있어 기능성 화장품이나 미용식품 등의 제조의 소재로 사용되고 있다[1,2]. 그러나 이들 미백 소재들은 주로 재배 기간이 긴 식물체들로부터 추출되고 대량 추출 등에 문제점이 있으므로 값싼 배지로 단시간에 경제적으로 대량 생산이 가능하면서 미백 활성이 높은 새로운 미생물로부터의 미백 소재 개발이 필요하다.
한편, 효모는 Cryptococcus neoformans와 Candida albicans 등 몇 종의 효모들만이 수막염이나 캔디다증을 일으키는 기회감염성 병원균으로 알려져 있을 뿐 대부분 비병원성이면서 GRAS 균주들로 오래 전부터 전통 발효 식품 제조[3]와 protease 등 산업용 효소 생산[4] 등에 이용되어 오고 있다. 최근에는 다양한 생리활성물질 생산에 이용되는 등 산업적으로 유용한 미생물이며[4-14] 또한 학술적으로 생명공학 연구의 이종단백질 생산을 위한 숙주 외에도 여러 가지 대사산물들의 분비 기작 연구 등에 이용되고 있다[7].
필자 등은 전보[15]에서 야생화에서 분리한 야생효모들 중 미백활성을 가진 tyrosinase 저해물질을 생산하는 야생효모들을 선발하였으나 활성이 비교적 낮았고 배지조성과 배양방법 등 대량생산을 위한 조건에서 비경제적인 문제점 등이 있었다. 따라서 본 연구에서는 이들의 단점을 보안할 수 있는 새로운 미백성 tyrosinase 저해활성이 우수한 야생효모들을 선별하여 이들을 기능성 화장품 산업에 응용하기 위하여 실시되었다.
이를 위해 먼저 대전 주요 하천과 충남 금산의 향신료 재배지역의 토양과 부식물 등에서 분리한 비병원성 야생효모들 중 미백성 tyrosinase 저해활성이 우수한 2종류의 야생효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성과 피부노화관련 elastase와 collagenase 저해활성등을 측정하였다. 또한, tyrosinase 저해물질 생산 최적 조건을 조사하였다.
재료 및 방법
야생효모 균주 및 재료
미백성 tyrosinase 저해 물질 생산 우수 효모 선발을 위한 야생효모들은 배재대학교 생물공학연구실에서 대전광역시 3대 하천들과 충남 금산의 향신료 재배지역의 토양과 부식물 등에서 분리, 동정한 비병원성 야생효모들을 사용하였다[16].
Tyrosinase 저해활성 측정에는 Sigma사(St. Louis, Mo, USA)의 tyrosinase 와 ELISA reader를 사용하였고, 피부 노화 관련 효소활성 실험에는 elastase (돼지 췌장으로부터 생산), collagenase (Clostridium histolyticum으로부터 생산) 등을 사용하였다. 기타, 효소활성 측정과 완충용액 제조 등에는 분석용 특급 시약들을 사용하였다.
야생효모 무세포 추출물의 제조 및 Tyrosinase 저해활성 측정
야생효모들을 yeast extract-peptone-dextrose (YPD) 배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 8000 rpm으로 20분간 원심분리하여 세포 균체들을 얻었다. 세포 균체들을 다시 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.3)에 현탁 시킨 후 초음파 균체파쇄기 (Vibra Cell; Sonics & Materials, Newtown, CT, USA)로 파쇄하고 12,000 rpm으로 20 분간 원심분리하여 무세포 추출물을 얻었다.
이들 무세포 추출물들을 동결건조 시킨 후 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8)에 10 mg·mL로 용해시켜 tyrosinase 저해활성 측정용 시료로 사용하였다[17,18].
Tyrosinase 저해활성은 위와 같이 제조한 야생효모 무세포 추출물 시료 50 μL에 0.1 M potassium phosphate 완충용액(pH 6.8) 100 μL와 1.5 mM L-tyrosine 50 μL를 혼합 후 37℃에서 ELISA reader를 이용하여 5분간 반응시킨 후 tyrosinase 40U을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 470 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같은 식으로 tyrosinase 저해활성을 계산하였다[15].
Tyrosinase 저해활성(%) = {C-(T-B)}/C×100 (1)
(C, 대조구의 흡광도; T, 시료구의 흡광도; B, 시료구 blank의 흡광도)
주름생성과 피부노화억제 관련 생리활성 측정
Elastase 저해활성; 야생효모 무세포 추출물 시료 50 μL에 0.2 M Tris-HCl 완충용액(pH 8.0) 150 μL, 4 mM N-Succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 50 μL 혼합 후 ELISA reader를 이용하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 elastase (0.2 unit·mL) 50 μL을 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 410 nm에서 흡광도를 측정하여 아래와 같은 식으로 elastase 저해 활성을 계산하였다[19].
Elastase 저해활성(%) = {C-(T-B)}/C×100 (2)
(C, 대조구의 흡광도; T, 시료구의 흡광도; B, 시료구 blank의 흡광도)
Collagenase저해활성; 야생효모 무세포 추출물 시료 50 μL에 4 mM CaCl2를 함유한 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 125 μL와 collagenase (0.5 mg·mL) 125 μL를 혼합 후 37℃에 20분 동안 반응 후 6% 구연산 용액 200 μL로 반응을 정지시키고 ethyl acetate 700 μL를 첨가하였다.
30초 vortex를 한 뒤 원심분리 후 상층액 200 μL를 취하여 ELISA reader를 이용해 340 nm에서 활성을 측정한 후 아래와 같은 식으로 collagenase 저해활성을 계산하였다[20].
Collagenase 저해활성(%)={1-(T-T.B/C-B)}×100 (3)
(C, 대조구 흡광도; T, 시료구 흡광도; T.B, 시료구 blank 흡광도; B, 대조구 blank 흡광도)
항산화 활성; 야생효모 무세포 추출물 60 μL에 DPPH(α-dipenyl-β-picrylhydrazyl) 240 μL 혼합한 후 ELISA reader를 이용하여 525 nm에서 10분 동안 흡광도를 측정한 후 아래와 같은 식으로 DPPH 활성을 계산하였다. 대조구는 99.5% EtOH 60 μL에 DPPH 240 μL를 혼합한 것으로 하였다(20).
DPPH 활성(%) = 1-{T10-(T0-C)}/C×100 (4)
(C, 대조구의 흡광도; T0, 시료구의 0분 흡광도; T10, 시료구의 10분 흡광도)
SOD 유사 활성; 야생효모 무세포 추출물 285 μL와 24 mM pyrogallol 15 μL를 혼합 후 ELISA reader를 이용하여 420 nm에서 10분 동안 흡광도를 측정한 후 아래와 같은 식으로 SOD 유사활성을 계산하였다. 대조구는 55 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.2) 285 μL와 pyrogallol 15 μL를 혼합한 것으로 하였다[21].
SOD 유사 활성(%) = {(C-T)/C}×100 (5)
(C, 대조구 흡광도; T, 시료구 흡광도)
선발균주의 균학적 특성
선발균주들의 미생물학적 특성으로 형태학적, 배양학적 특성 등은 일반 미생물 실험방법과 현미경 등을 이용하여 조사하였고[22,23] 당 자화성과 발효성은 yeast nitrogen base를 이용하여 측정하였다.
결과 및 고찰
미백성 tyrosinase 저해활성 우수 효모 균주의 선발
대전광역시 3대 주요하천들과 충남 금산의 향신료 재배지들의 토양과 식물체 부식물 등에서 분리, 동정한 야생효모 중 비병원성 효모들의 미백성 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다.
먼저, 대전광역시내를 흐르는 대전천, 유등천, 갑천 등에서 분리한 비병원성 야생효모들의 무세포 추출물들을 제조하여 이들의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다.
대전천 주변 토양에서 분리한 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) WJSL0191 균주의 tyrosinase 저해활성이 33.2%로 분리균주중 가장 높았고 S. cerevisiae WJSL0088 균주도 21.3%의 저해활성을 보였으나 나머지 야생효모들은 대부분 15% 미만이거나 활성이 없었다. 따라서 tyrosinase 저해활성이 가장 높은 S. cerevisiae WJSL 0191을 우수 균주로 선발하였다.
선발균주인 S. cerevisiae는 비병원성이면서 GRAS 균주로 오래전부터 주류 등의 전통 발효 식품과 빵 효모 등으로 이용되어오고 있고 최근에는 항고혈압활성 안지오텐신전환효소 저해활성[7]과 항치매성 β-secretase 저해활성[8]과 acetylcholinesterase 저해활성[9], 암전이 억제성 혈관신생 억제활성[5]등 다양한 생리활성들이 보고되어 약용효모로도 매우 주목을 받고 있는 산업적으로 유용한 효모이다.
비록, 선발 야생효모 S. cerevisiae WJSL 0191의 tyrosinase 저해활성이 Diutina siamensis JR37-5의 30.9%와 Starmerella bombicola 80-J-1의 36.2%들[15]과 비슷하거나 약간 낮은 저해활성이었지만 아래와 같은 생산조건의 최적화 연구를 통해 저해활성을 크게 증진시킬 수 있었고 선발균주가 전통 발효식품 산업에 오랫동안 이용되고 있는 GRAS 균주이기 때문에 이 야생효모 균주를 이용한 고부가 가치의 기능성 미용 화장품 소재로서의 산업적 응용성이 매우 클 것으로 사료된다.
한편, 향신료 재배지 주변 토양에서 분리한 비병원성 야생 효모들의 무세포 추출물들의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 이들 야생효모들 중 양파 재배 토양에서 분리한 Papiliotrema laurentii (P. laurentii) ON 30이 tyrosinase 저해활성이 27.3%로 가장 높았고, 마늘 재배 토양에서 분리한 Meyerozyma guilliermondii M1C-3균주도 19.7%를 보였다. 따라서 우수 균주로 최종 P. laurentii ON30을 선발하였다.
선발균주인 P. laurentii에 관한 연구로 Sarkar등[24]은 본 균주가 질소원이 결핍된 배지에서도 생육이 왕성한 결과를 토대로 이 균의 질소원 스트레스에 대한 전사체 분석 등의 생화학적 연구 등을 실시하여 보고하였다. 또한 Wang등[25]은 바이오 디젤 생산을 위한 P. laurentii의 inulin 가수분해와 오일 생산 등에 관하여 보고하였다.
Table 1. Tyrosinase inhibitory activities of non-pathogenic wild yeasts obtained from main riverside soils of Daejeon city, Korea.
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an.d; not detected, bold type font; selected yeast |
Table 2. Tyrosinase inhibitory activities of non-pathogenic, wild yeasts obtained from spices field of Geumsan in Chungcheongnam-do, Korea.
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an.d; not detected, bold type font; selected yeast |
Tyrosinase 저해활성 우수 효모 균주들의 균학적 특성과 생리활성
균학적 특성 위와 같이 Tyrosinase 저해물질 생산 우수 균주로 선발한 야생효모 S. cerevisiae WJSL 0191와 P. laurentii ON30 균주들의 분석된 염기서열을 NCBI에 BLAST하여 유사도를 확인한후, 이를바탕으로 분자 계통수를 작성하였다. 이때 bootstrap분석은 2,000회 반복으로 수행되었고 MEGA-X [26]를 이용하여 neighbor-joining계통수를 완성하였으며 outgroup균주들로는 각각 Hanseniaspora opuntiae와 Trimella monformis 들을 사용하였다. 이들 두 균주들의 phylogenetic tree는 Fig. 1과 같고, 형태학적, 배양학적 특징들을 조사한 결과는 Table 3과 같다.
Fig. 1. Phylogenetic tree of the tyrosinase inhibitor – producing wild yeasts, based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MrGA 7. (A) Saccharomyces cerevisiae WJSL0191, (B) Papiliotrema laurentii ON 30. (bold type font; selected yeast)
이들 균주들의 세포의 형태는 구형~타원형으로 출아에 의해 영양증식을 하였고 모두 자낭포자를 형성하였으나 의균사를 형성하지 않았다.
또한, 선발균주 모두 YPD 배지와 yeast extract-malt extract배지에서 잘 생육하였고 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서도 잘 생육하였다. 선발균주 모두 20% 포도당을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 내당성을 보였고, 5% NaCl을 함유한 YPD 배지에서 생육하는 호염성 효모들이었다. 특히 S. cerevisiae WJSL0191은 일반적으로 주류 제조나 빵 효모로 이용되는 Saccharomyces cerevisiae 와 달리 20% 포도당 함유 YPD 배지와 15% NaCl 함유 YPD 배지에서도 잘 생육하는 강한 내당성과 호염성을 보여 산업적 응용성이 매우 클 것으로 사료된다.
또한 선발균주 모두 일반적인 효모들과 유사하게 pH 5.0-6.0에서 잘 생육하였으나 S. cerevisiae WJSL0191만이 일반 효모들같이 20-30℃에서 생육이 좋았으나 P. laurentii ON 30은 조금 더 높은 온도인 20-35℃에서 생육하여 내열성을 보였다.
한편, 이들 2종류의 미기록 균주들의 당 자화성을 조사한 결과 S. cerevisiae WJSL0191는 glucose, galactose, fructose, maltose, sucrose, mannose, raffinose, cellulose, 전분등을 자화 시켰고 glucose, galactose, maltose등을 발효시켰다(Table 3). 그러나, P. laurentii ON 30는 glucose와 maltose만을 자화시켰고 시험에 사용한 모든 당들을 발효시키지 못하였다.
주름생성 억제와 피부 노화 관련 생리활성
Tyrsoinase 저해물질 생산 우수 야생효모들의 주름생성 억제와 피부 노화관련 생리활성으로 elastase와 collagenase 저해활성들과 항산화 활성, SOD 유사 활성 등을 측정하였다(Table 3).
주름생성 원인이 되는 elastase에 대한 저해활성은 S. cerevisiae WJSL0191이 26.2%로 비교적 높았고 P. laurentii ON30도 18.6%를 보였다. 또한 SOD 유사 활성은 S. cerevisiae WJSL0191이 10.2%를 보였을 뿐, collagenase 저해활성과 항산화 활성들은 없거나 10% 미만의 낮은 활성을 보였다.
한편, elastase 저해활성이 우수했던 S. cerevisiae WJSL0191 균주의 elastase 저해물질 생산 최적 배양 시간의 영향을 조사한 결과 배양 48시간에 30.0%, 72시간에 32.4%를 보였다(data not shown).
Tyrosinase 저해물질 생산 조건
배양온도의 영향; 위와 같이 Tyrosinase 저해활성 우수 균주로 최종 선발한 S. cerevisiae WJSL0191 와 P. laurentii ON 30들을 YPD 배지에 접종하여 15℃에서 40℃까지 일정온도에서 24시간 배양한 후 균 생육과 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 두 균 모두 생육은 20℃와 30℃에서 매우 좋았고 특히 S. cerevisiae WJSL0191는 40℃에서도 비교적 생육이 양호하였다(Fig. 2). Tyrosinase 저해활성은 S. cerevisiae WJSL0191 균주가 30℃에서 배양하였을 때 34.0%로 가장 높았고 20℃에서도 21%를 보인 반면에 P. laurentii ON30는 20℃에서 가장 높았고(32.6%), 30℃ 배양에서는 26%를 보였다. 15℃배양에서는 각각 11%와 8.0%, 40℃ 배양에서는 13%와 2.3%로 매우 낮았다(Fig. 2).
) and Papiliotrema laurentii ON30 (
).배양시간의 영향; 우수 균주로 선발한 야생효모, S. cerevisiae WJSL0191의 균 생육과 tyrosinase 저해활성에 미치는 배양시간의 영향을 조사한 결과 Fig. 3과 같다. Tyrosinase 저해활성은 배양시간이 길어짐에 따라 증가하여 균 생육이 대수기 말기인 배양 48시간에 약 63.5%를 보였고 균 생육이 정지기에 들어가는 배양 72시간에 tyrosinase 저해활성이 96.1%로 크게 증가하여 최고 저해활성을 보인 후 배양 96시간에 약간 감소하는 경향이었다.
또한, P. laurentii ON30의 배양시간에 따른 균 생육과 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 배양 12시간 후 대수기 중기부터 tyrosinase 저해활성이 20.6%로 급격히 증가한 후 배양 24시간에 30.4%로 최고에 달한 후 48시간까지 점점 낮아지는 경향이었다(Fig. 3).
위와 같이 tyrosinase 저해물질 생산 우수 균주로 선발한 S. cerevisiae WJSL0191과 P. laurentii ON30 들의 tyrosinase 저해물질 생산 조건을 비교한 결과 두 균주 모두 tyrosinase 저해물질 생산에 제일 적합한 배지는 YPD 배지이었고 배양온도는 20℃~30℃에서 제일 좋았다. 그러나 P. laurentii ON30 은 최적 배양시간이 24시간으로 매우 짧은 반면에 tyrosinase 저해활성은 30.4%로 낮았고 S. cerevisiae WJSL0191은 tyrosinase 저해활성이 96.1%로 높은 반면에 배양시간이 72시간으로 비교적 길었다.
최종적으로 경제성과 산업적 응용성등을 고려했을 때 S. cerevisiae WJSL0191 균주가 P. laurentii ON30보다 비록 배양시간이 48시간 길었지만 tyrosinase 저해활성이 3배 이상 높아 tyrosinase 저해물질 대량생산을 통한 산업적 응용에 더 적합한 것으로 사료된다.
적요
본 연구는 야생효모로부터 미백성 tyrosinase 저해 물질을 생산하여 기능성 화장품 생산에 응용할 목적으로 실시되었다. 이를위해 대전광역시 3대 하천과 충남 금산의 향신료 재배지의 주변 토양들과 부식물 등에서 분리한 비병원성 효모들의 tyrosinase 저해활성을 측정하여 우수 균주들을 선발하여 이들의 균학적 특성과 tyrosinase 저해제 생산 조건을 조사하였다. 먼저 대전시 하천에서 분리한 야생효모들 중에서는 S. cerevisiae WJSL0191의 무세포추출물이 가장높은 33.2%의 tyrosinase 저해활성을 보였고 금산 향신료 재배지에서 분리한 효모중에서는 P. laurentii ON30가 27.3%로 가장 높은 활성을 보여 이들 두 효모들을 우수균주들로 최종 선발하였다. 선발균주 모두 자낭포자를 형성하였으나 의균사를 형성하지 않았고 YPD 배지와 비타민을 첨가하지 않은 YPD 배지에서 잘 생육하였다. 특히 S. cerevisiae WJSL0191은 20% 포도당을 함유한 YPD 배지와 15% NaC을 함유한 YPD 배지에서 잘 생육하는 내당성과 호염성을 보였다. S. cerevisiae WJSL0191과 P. laurentii ON30의 주름생성 억제에 관련된 elastase 저해 활성은 각각 26.2, 18.6%를 보였고 노화 억제관련 SOD유사활성은 각각 10.2%와 3.7%로 나타내었다. S. cerevisiae WJSL0191의 tyrosinase 저해물질의 최적 생산 조건은 30℃에서 72시간동안 YPD 배지에서 배양하였을 때 최고 96.1%의 저해활성을 보였고, P. laurentii ON30은 YPD 배지로 20℃에서 24시간 배양하였을 때 30.4%의 최고 저해활성을 나타내었다.
