서론
진균류의 일종인 효모의 다양한 생리활성등이 최근 보고[1-6]되어 이들의 산업성 응용성이 증가되고 있지만 지금까지의 효모는 주로 전통발효식품이나 이들의 주,부원료로부터 분리, 동정되었다[5]. 그러나 최근 각 나라마다 자국의 생물자원 보호와 새로운 생물자원의 탐색등에 관한 연구 필요성이 대두됨에 따라[7] 우리나라도 2000년에 들어와 자연환경과 담수환경등으로부터의 새로운 균류 발굴과 이들의 이용개발에 관한 연구가 시작되었다. 특히 야생효모의 분리와 국내 미기록효모의 발굴 연구도 2011년부터 본격적으로 시작되어 야생화와 토양등으로부터 많은 야생효모등이 분리, 동정되었다[8-18,19-22]. 최근에는 담수환경인 금강과 영산강, 낙동강등으로부터 다양한 야생 효모들이 분리, 동정되어 보고되었고[23-28] 이들 둥 국내 미기록 야생효모들을 선별과 이들의 미생물학적 특성 등이 보고되었다[24-28].
해금강은 남해안 한려수도 해상공원중 바다의 금강산이라 불리울 정도의 아룸다운 기암절벽이 많고 주변에 해수욕장이 많아 매년 수만명의 사람들이 다녀가는 휴양관광지이다. 또한 전라북도와 충청남도의 도계에 위치한 무주는 겨울철 스키휴양지 이고 금강의 본원지인 덕유산 자락에 있으며 주변에 남대천과 주상천등이 금강상류의 본류를 형성하고 이들이 금산 제원천, 금산천등을 지나 금강 중류인 대전의 대청호로 유입된다. 지금까지 남해안 최대 휴양지인 해금강과 금강 상류 무주 주변 하천등의 효모 균류 발굴은 지금까지 이루어지지 않았다.
따라서 본 연구에서는 남해안 해금강과 주변 해수욕장, 금강 상류인 전북 무주군 무주읍을 지나는 남대천과 충남 금산군 금산읍 금산천의 야생효모 종 분포특성을 알아보기 위해 이들 주변의 물과 토양 등으로부터 야생효모들을 분리하여 동정하였다. 또한, 이들 야생효모들 중 국내에 보고되지 않은 미기록 야생효모들을 선별하여 이들의 미생물학적 특성을 조사하였다.
재료 및 방법
야생효모의 분리 및 동정
경상남도 남해안에 있는 해금강(34º44'12.9''N, 128º40'31.4''E)과 금강상류 전북 무주군 남대천(36º0'20.6''N, 127º39'37.8''E) 및 충남 금산군 금산천(36º6'7.3''N, 127º29'17.8''E) 주변의 물, 토양과 부식물등 시료 125점들을 2022년 4월부터 6월사이에 무균적으로 채취하여 멸균 튜브에 넣고, 5 mL의 멸균수를 첨가한 후 3시간 동안 진탕하였다. 이들 현탁액 0.5 mL를 스트렙토마이신(100 µg/mL)과 앰피실린(100 µg/mL)이 들어 있는 YPD (yeast extract-peptone-dextrose)한천배지에 도말하고 30℃에서 72시간까지 배양하면서 형성된 효모 집락들을 일반 야생 효모균주로 분리하였다[25]. 또한 3% NaCl을 함유한 YPD배지에서 생육한 효모들을 내염성 야생효모로 분리하였다.
분리효모들의 분자계통분류학적 동정을 위하여 먼저 NL1 (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)와 NL4 (5’-CGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) primer를 이용하여 26S rDNA의 D1/D2 부위를 PCR로 증폭한 후 염기서열들을 결정하였다(Cosmogenetech, Daejeon, Korea). 결정된 염기서열들을 NCBI의 BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)를 사용하여 데이터베이스에 등록되어 있는 효모들과의 상동성 비교한 후, 분자생물학적 유연관계를 분석하여 동정하였다[26].
국내 미기록 효모들의 선별 및 특성
위와 같이 분리, 동정한 야생효모들을 대상으로 국립 생물자원관 DB와 한국 진균관련 학술자료들을 이용하여 국내 미기록 효모들을 선별한후 일반 미생물 실험방법 등을 이용하여 이들의 모양, 크기, 포자 및 의균사형성 유무 등의 형태학적 특성과 최적 배지, 배양온도 등의 배양학적 특성을 조사하였다[25,26]. 또한 탄소원들에 대한 자화성과 발효성은 Yeast nitrogen base (Difco, USA) 배지에 시험 탄소원들을 각각 첨가하여 배양한 후 660 nm에서 흡광도를 측정, 생육정도를 확인하여 자화성을 판정하였고 배지에 추가한 Durham관의 이산화탄소 생성 유무를 확인하여 발효성을 조사하였다. 또한, YPD배지에 CoCl2등의 중금속들을 400 ppm과 800 ppm씩 각각 첨가하여 30℃에서 3일간 배양한후 660 nm에서의 흡광도를 측정, 이들의 생육도를 확인하여 내성을 조사하였다[26].
결과 및 고찰
해금강과 무주 남대천 및 금산 금산천 주변 환경으로부터 야생효모의 분리 및 동정
남해안 해금강 주변 물, 토양등의 시료 35점에서 일반효모 14종 27균주, 내(호)염성 효모 8종 25균주등 총 22종 52균주의 야생 효모를 분리, 동정하였다(Table 1). 이들중 특히 Rhodotonular mucilaginosa 균주가 25균주로 우점균이었고 11균주들이 호염성 효모들이었다.
금강 상류인 무주군 남대천 주변 물과 토양 30점에서 24종 43균주의 야생효모들을 분리, 동정하였고, 이 지역에서도 Rhodotonular mucilaginosa 가 가장 많이 분리되었다(Table 2). 또한 금강상류 금산군 진악산에서 발원하여 금산읍내를 흐르는 금산천 주변 물과 토양 60점에서 79균주의 야생효모들을 분리, 동정하였다(Table 3). 이들 시료에서도 해금강과 남대천에서와 같이 Rhodotonular 속 균이 특히 많이 분리되었다. 시내를 흐르는 남대천과 금산천 주변에서 일부 병원성 야생효모들이 다른 강이나 호수보다 더 많이 분리되었는데, 이는 이들 천변지역에 있는 재래시장과 주택 및 축사등으로부터 생활폐수와 일부 축산폐수등이 유입되는것과 연관이 있을것으로 추정된다.
한편 이들 지역에서 분리된 우점균들은 지금까지 필자등이 금강중류 공주, 대전등지에서 우점균으로 Candida 속 균, Bullera 속 균, Cryptococcus 속 균, Rhodotonular 속 균, Hansenia 속 균 등을 분리한 결과와 영산강과 낙동강[20] 시료 등에서도 우점균으로 보고된 Cryptococcus 속 균, Rhodotonular 속 균, Candida 속 균들과 유사한 분포경향을 보였다.
국내 미기록 야생효모들의 미생물학적 특성 및 효소활성
위와같이 남해안 해금강과 무주 남대천 및 금산의 금산천 주변에서 분리한 야생효모들중 Exobasidium rhododendri HGG10-5 (NNIBR2022633FG1), Udeniomyces pyricola NDC29-1 (NNIBR2022633FG2), Pichia scaptomyzae BAC2-3 (NNIBR2022633FG4), Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 (NNIBR2022633FG5) 등 야생균주들이 우리나라에서 아직까지 보고되지 않은 국내 미기록 야생효모들로 최종 선별되었다.
Table 2. Wild yeast strains from waters and soils of Namdaecheon in Muju-gun of Jeollabuk-do, Korea.
|
Table 3. Wild yeast strains from waters and soils of Geumsancheon in Geumsan-gun of Chungcheongnam-do, Korea.
|
Table 3. Wild yeast strains from waters and soils of Geumsancheon in Geumsan-gun of Chungcheongnam-do, Korea.
|
이들 국내 미기록 효모들에 대한 외국 학술지의 주요 보고 내용으로 먼저 Exobasidium rhododendri 는 처음 담자리참꽃(알프스 장미)의 잎과 줄기에 기생하는 균으로 분리되었고[29] 이 균은 다른 담자균속균과 달리 숙주 식물의 조직에서 영양증식을 하는것으로 알려졌다. Udeniomyces pyricola 는 Nakase 등이[30] 처음 분리하여 이들의 형태적 특성과 생육특성, 발효성등을 보고하였고 Diddensiella caesifluorescens 균주는 Petere등[31]이 riboflavin 생산 효모로 분리, 동정하여 보고하였다. 또한 Pichia scaptomyzae 균주는 칠레 남부에 서식하는 상시류의 일종인 Scaptomyza multispora의 소화기관에서 처음 분리되어 이들의 형태학적, 생리적 특성등이 보고된바 있다[32].
형태학적, 배양학적 특성 및 중금속 이온들에 대한 내성; 이들 미기록 효모들을 YPD배지에 접종하여 30℃에서 2일 배양한 후 광학 현미경(BX43F, OLYMPUS, JAPAN)으로 이들의 형태를 관찰하였고(Fig. 1) 크기, 포자형성 유무등의 형태적 특징과 배양적 특성 및 이들의 phylogenetic trees는 각각 Table 4, Fig. 2, Fig. 3와 같다. 이들 미기록 효모들중 Udeniomyces pyricola NDC29-1 와 Diddensiella caesifluorescens GSC2-2는 구형이고 나머지 균들은 난형으로 출아에 의해 영양증식을 하였으며 Pichia scaptomyzae BAC2-3 균주만이 포자를 생성하였다. Udeniomyces pyricola NDC29-1 균주외 모든 미기록 균주들이 vitamin-free배지에서도 생육이 아주 양호 하였고 Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 균주와 Pichia scaptomyzae BAC2-3 균주는 40% 포도당을 함유한 YPD배지에서 모두 생육이 양호하였다. 한편, 미기록 야생 효모들 중 특히 Pichia scaptomyzae BAC2-3 균주는 Ca, Mg, Zn, Li, Co, Cu, Fe 등의 중금속 이온들에 대하여 800 ppm에서도 생육하는 내성을 보였다.
탄소원들에 대한 자화성과 발효성; 위와 같은 미기록 야생효모들의 각종 당류들에 대한 자화성과 발효성을 조사한 결과는 Table 3과 같다. 미기록 효모들 모두 fructose와 lactose, raffinose, xylose, 전분등을 자화시켰고 섬유소를 자화시키지 못하였다. 또한 4균주 모두 시험에 사용한 포도당 등 10종의 당류들을 발효시키지 못하였다.
Fig. 2.Phylogenetic tree of the unrecorded yeasts, Pichia scaptomyzae BAC2-3 (A) and Udeniomyces pyricola NDC29-1(B) isolated from waters and soils of Namdaecheon in Geumgang upstream of Korea, based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/ D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MEGA X.NDC29-1.
Fig. 3.Phylogenetic tree of the unrecorded yeasts, Exobasidium rhododendri HGG10-5 (A) and Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 (B) isolated from waters and soils of Haegeumgang in southern sea and Geumsancheon in Geumgang upstream of Korea, based on the nucleotide sequences of large subunit 26S ribosomal DNA D1/D2 region. The tree was generated by the neighbor-joining method, using MEGA X.
적요
남해안과 금강상류 주변환경의 야생효모들의 효모 종 분포특성을 조사하고 국내 미보고된 효모들을 선별하여 이들의 균학적 특성들을 알아보고자 남해안의 해금강과 금강상류인 전북 무주의 남대천 및 금산의 금산천 주변의 물과 토양들로부터 야생효모들을 분리, 동정하였다. 해금강 주변 시료 35점에서 22종 52균주의 야생효모들을 분리, 동정하였고 무주의 남대천 주변 물과 토양 30점에서는 24 종 43균주의 야생효모들을, 금산의 금산천변 시료 60점에서 45종 79균주의 야생효모들을 분리, 동정하였다. 이들 지역에서 분리, 동정한 야생효모들중 Exobasidium rhododendri HHG10-5 (NNIBR2022633FG1), Udeniomyces pyricola NDC29-1 (NNIBR2022633FG2), Pichia scaptomyzae BAC2-3 (NNIBR2022633FG4), Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 (NNIBR2022633FG5) 등 4균주들이 국내 미기록 야생효모들로 최종 선별되었다. 이들의 균학적 특성을 조사한 결과 Udeniomyces pyricola NDC29-1 과 Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 균은 구형이었고 Exobasidium rhododendri HGG10-5 와 Pichia scaptomyzae BAC2-2 균들은 난형이었으며 Pichia scaptomyzae BAC2-3 균주만이 포자를 생성하였다. Udeniomyces pyricola NDC29-1 균주 외에는 모두 vitamin-free배지에서도 생육이 아주 양호하였고 Pichia scaptomyzae BAC2-3, Diddensiella caesifluorescens GSC2-2 균주는 40% glucose 를 함유한 YPD배지에서도 생육하는 내당성균이었다. Udeniomyces pyricola NDC29-1 균주를 제외한 나머지 균들은 Ca 등의 중금속등에 대하여 강한 내성을 보였다.
