INTRODUCTION
곰팡이는 복합적인 유기물에서 영양분과 탄소원 등을 얻기 위해 세포외분해효소를 생산한다. 이러한 효소들은 일반적으로 다당체를 가수분해하여 단당체로 만들어 세포내로 흡수되도록 한다. 이러한 작용들은 자연상태에서 유기물 분해 및 무기물화를 통해 생태계 순환이 이루어지도록 한다. 곰팡이가 분비하는 세포외분해효소는 다양하며 산업적으로도 많이 이용되고 있다[1]. proteinase는 자연계에 널리퍼져 있는 중요한 효소로서 식품산업[2], 의약품[3], 세제[4] 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. amylase와 cellulase는 섬유산업[5], 세제[6], 펄프 및 제지 산업 등에 널리 사용되며, cellulase는 lingo-cellulose의 에탈올로 생물전환 시키는데 중요한 역할을 한다[7]. Lipase 역시 산업적 응용이 광범위하며 폐수 처리에도 사용하고 있다[8]. 미생물을 이용한 생물학적 방제로 키틴을 분해할 수 있는 chitinase에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 키틴은 각종 갑각류의 외피, 곰팡이 세포벽의 구성성분으로 chitinase를 생성하는 미생물을 이용한 살충 및 살균제에 이용하고 있다[9]. Laccase는 최근에는 바이오연료 및 바이오센서 연구에 이용되며, 생촉매 작용을 통해 식품, 화장품 산업 등에서 널리 활용된다[10].
담수에서 서식하는 곰팡이(aquatic hyphomycetes)는 물 속의 오래된 나뭇잎 등 유기물에서 주로 발견된다. 목재는 수용성 당, 지질, hemicellulose, cellulose, 리그닌 같은 성분으로 이루어져 있어 이들을 분해하기 위해서는 복합적인 세포외분해효소를 생산한다[11].
본 연구에서는 담수의 토양, 유기물 등에서 분리한 곰팡이 40개 균주들의 proteinase, cellulase 등 6가지 세포외분해효소를 생성하는지를 조사하였다.
재료 및 방법
채집 및 균류 분리
담수환경에서 서식하는 곰팡이를 분리하기 위해, 다양한 담수환경에서 시료를 채집하였다. 균주별 채집지 및 분리원은 Table 1에 보여지는 바와 같다. 담수시료는 현장에서 바로 핸드펌프를 사용하여 50 mL 현장수를 MCE membrane filter (HAWP04700, MF-MilliporeTM, Tullagreen, Ireland)를 이용하여 여과한 후 여과지를 water agar (WA; 20 g/L agar, 1 L distilled water, streptomycin 100 ppm)배지에 올려놓는다. 실험실로 가져와 15℃에서 배양하며 단포자 분리하였다. 순수분리된 균류는 potato dextrose agar (PDA; Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, USA)배지에 접종하고 20℃에 배양하였다.
채집한 담수침전식물체를 멸균수에 2번 세척한 후 멸균수에 넣고 20℃에서 일주일 정도 배양한 후, 배양된 물 100 µL를 WA 배지에 도말하고 2일 동안 15℃에서 배양하였다. 채집한 토양시료는102, 103, 104으로 희석하여 200 µL를 PDA 배지에 도말한 후 15℃에서 배양하며 균을 분리하였다. 분리된 곰팡이는 15% 글리세롤에 담은 후 -80℃에 저장하였다.
분리된 균류의 동정
분리된 균주를 동정하기 위해 PDA에 배양한 균사체를 수확하여 glass bead가 담긴 tube에 넣고 균질화시킨 후 Nucleospinn® Plant II DNA extraction Kit (Macherey-Nagel, Düren, German)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 internal transcribed spacer (ITS) rDNA 유전자 분석을 위해 ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 및 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다[12]. DNA 염기서열 정렬 및 편집, 계통수 작성을 위해 MEGA 11을 사용하였다[13].
Proteinase 활성 탐색
분리된 곰팡이의 proteinase 활성을 측정하기 위해 1% malt extract agar (1% MEA; 1% malt extract, 15% agar)에 1% skim milk과 0.05% congo red를 첨가하여 조제한 배지에 곰팡이를 접종하였다. 25℃에서 7-10일 동안 관찰하면서 붉은색 배지가 투명하게 변하는지 관찰하였다.
Amylase 활성 탐색
분리된 곰팡이의 amylase 활성을 측정하기 위해 1% malt extract agar (1% MEA; 1% malt extract, 15% agar)에 0.5% soluble starch과 0.05% congo red를 첨가하여 조제한 배지에 곰팡이를 접종하였다. 25℃에서 7-10일 동안 관찰하면서 붉은색 배지가 투명하게 변하는지 관찰하였다.
Lipase 활성 탐색
분리된 곰팡이의 lipase 활성을 측정하기 위해 1% malt extract agar (1% MEA; 1% malt extract, 15% agar)에 0.5% tween20 (Sigma, St. Louis, USA)과 0.05% congo red를 첨가하여 조제한 배지에 곰팡이를 접종하였다. 25℃에서 7-10일 동안 관찰하면서 붉은색 배지가 투명하게 변하는지 관찰하였다.
Cellulase 활성 탐색
분리된 곰팡이의 cellulase 활성을 측정하기 위해 1% malt extract agar (1% MEA; 1% malt extract, 15% agar)에 1% carboxymethyl cellulose (CMC)과 0.05% congo red를 첨가하여 조제한 배지에 곰팡이를 접종하였다. 25℃에서 7-10일 동안 관찰하면서 붉은색 배지가 투명하게 변하는지 관찰하였다.
결과
곰팡이의 동정
실험에 사용된 균주들은 2015-2018년에 걸쳐 담수환경에서 채집된 시료에서 분리한 곰팡이로 담수식물침전물에서 22개, 담수퇴적토에서 15개, 담수포말 및 담수시료에서 2개, 식물내생균 1개 균주가 분리 동정되었다(Table 1). 이들 곰팡이는 담수환경에서 유기물을 분해하는 분해자 역할을 하는 것으로 알려져 있는 수생균류(aquatic hyphomycetes) 중 국내에 보고된 Aquanectria penicillioides, Margaritispora aquatic, Filosporella exilis, F. fistucella, Lemonniera fraxinea, Tetracladium fraxineum이 포함되어 있으며[16-19], 담수환경에서 분리된 것으로 보고된 Colletotrichum godetiae, Discosia rubi, Monochaetia dimorphospora, Didymella segeticola, Did. ellipsoidea, Did. aeria, Nothophoma spiraeae, Mucor moelleri, Paraphaeosphaeria michotii, Penicillium scabrosum, Sarocladium kiliense 도 포함되어 있다[19-26]. 한편, 국내에 아직 보고되지 않은 Neostophoma italica, Microdochium paspali, Micorosphaeropsis arundinis 등 다양한 곰팡이들이 확인되었다. 각 균주들의 정보는 Table 1과 Fig. 1에 보여지고 있다.
세포외분해효소 활성
Proteinase 활성
Proteinase 활성을 검정한 결과, 40개 균주 중 21개 균주에서 활성이 나타났다. 이 중 Microdochium, Monochaetia 속 등 13개 균주에서 높은 활성을 보였다. Penicillium scabrosum NNIBRFG1470, Sarocladium kiliense NNIBRFG2180 균주는 protease 활성만 보였다(Table 2).
Fig. 1
The phylogenetic tree of the 84 strains using the Neighbor-Joining method. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1,000 replicates) are shown next to the branches. The evolutionary distances were computed using the Kimura 2-parameter method and are in the units of the number of base substitutions per site. The rate variation among sites was modeled with a gamma distribution (shape parameter=1). The differences in the composition bias among sequences were considered in evolutionary comparisons. All ambiguous positions were removed for each sequence pair (pairwise deletion option). There were a total of 634 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA11.
Amylase 활성
Amylase 활성을 가진 균주는 40개 중 15개 균주였으며, 이 중 Trichosporon porosum NNIBRFG334, Filosporella exilis NNIBRFG1552 균주에서 높은 활성을 보였다. T. porosum NNIBRFG334 균주는 protease, amylase, lipase, cellulase 효소에서 높은 활성을 보였으며 laccase 효소 활성도 보였다(Table 2).
Amylase 활성
Amylase 활성을 가진 균주는 40개 중 15개 균주였으며, 이 중 Trichosporon porosum NNIBRFG334, Filosporella exilis NNIBRFG1552 균주에서 높은 활성을 보였다. T. porosum NNIBRFG334 균주는 protease, amylase, lipase, cellulase 효소에서 높은 활성을 보였으며 laccase 효소 활성도 보였다(Table 2).
Cellulase 활성
Cellulase 활성은 Discosia rubi NNIBRFG203, Paraconiothyrium sp. NNIBRFG206, Mucor moelleri NNIBRFG207, Neosetophoma italica NNIBRFG245, Trichosporon porosum NNIBRFG334 5개 균주에서 나타났으며, 그 중 NNIBRFG334 균주에서 높은 활성을 보였다(Table 2).
Laccase 활성
Laccase 활성을 검정한 결과, 40개 균주 중 37개 균주에서 활성이 나타났다. 이 중 Auanectria penicilloides NNIBRFG41, Monochaetia dimorphospora NNIBRFG396, M. kansensis NNIBRFG868, Monochaetia sp. NNIBRFG3775, Stagonospora trichophoricola NNIBRFG2943, Sarocladium strictum NNIBRFG4092, Phialemoniopsis pluriloculosa NNIBRFG4126, Paramyrothecium viridisporum NNIBRFG4173의 8개 균주에서 높은 활성을 보였다(Table 2).
Chitinase 활성
Chitinase 활성을 검정한 결과, 40개 균주 중 Didymella segeticola NNIBRFG108, Nothophoma spiraeae NNIBRFG164, Microdochium paspali NNIBRFG247, Margaritispora aquatica NNIBRFG339, Monochaetia dimorphospora NNIBRFG396, Mocnochaetia sp. NNIBRFG3775, Leptosphaerulina trifolii NNIBRFG435, Microsphaeropsis arundinis NNIBRFG2634의 8개 균주에서 활성을 보였으며, NNIBRFG396 균주의 활성이 가장 높았다(Table 2).
고찰
담수환경에서 분리된 곰팡이 중 수생균류(aquatic hyphomycetes)로 알려진 곰팡이들은 대부분 부식된 목재나 식물잎에서 서식하면서 다양한 세포외분해효소를 생성하여 목재 등을 이루고 있는 지질, 당, 펩타이드, 헤미셀룰로오즈, 리그닌 등을 분해하여 양분을 얻는다. 목재는 20-30%의 리그닌으로 구성되어 있어 이에 서식하는 곰팡이는 리그닌, 셀룰로오스 등을 분해할 수 효소 활성을 가진다[11]. 본 연구에서도 담수환경에서 분리된 균주 40개 중 37개에서 laccase 활성을 보이는 것을 확인하였다. 담수환경에 서식하는 곰팡이들은 lignocellulytic 효소(laccase, cellulase 등)를 생성하여 식물체 유기물을 분해하여 생태계 순환하도록 하는 역할을 한다.
Colletotrichum, Phomopsis, Didymella 속 등은 다양한 기주식물에 기생 또는 부생하여 병을 일으키는 병원균 또는 식물내생균으로도 알려져 있다. 이들 곰팡이는 amylase, pectinase 또는 laccase 등을 생성하여 식물의 방어시스템을 억제시키거나 살균제를 무독화시키는 등 식물에 침투가 용이할 수 있게 한다. 이러한 작용은 곰팡이가 환경에 적응하여 식물 유기물을 분해하는데 최적의 조건을 만들어준다[24].
플라스틱 오염 문제가 대두됨에 따라 미생물을 활용하여 난분해성 물질의 생분해 관련 연구가 이루어지고 있다. 곰팡이가 생성하는 laccase 같은 산화효소를 이용한 비스페놀A를 분해하는 것이 보고되어 있으며, 다양한 세포외분해효소 활성을 이용한 플라스틱 분해에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다[25,26].
본 논문에서 연구에 사용한 균주들은 최근 보고되었거나 국내에 잘 알려지지 않은 미기록종으로 많은 연구가 이루어지지 않은 실정이다. 세포외분해효소에 대한 정보는 다양한 연구분야의 기초자료로서 활용 가능하므로 본 연구를 통해 확보된 담수에서 분리된 곰팡이들의 세포외분해효소 활성에 대한 기초자료는 향후 다른 연구에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.
