효모는 전통적으로 발효에 중요한 역할을 해 오고 있는미생물이며, 자연계 및 여러 식품으로부터 분리되어 왔다. [1-4]. 뿌리 등 식물의 지하부를 표현하는 근권(rhizosphere)에 대비하는 용어로서, 줄기, 잎, 꽃, 과일 등 식물의 지상부를 엽권(phyllosphere)이라 하는데, 엽권에 존재하는 효모의 다양성 및 밀도에 관한 연구는 지금까지 많지 않다[5]. 효모는 식물 영양소를 소비하며, 식물 대사를 촉진시키고, 식물의 병원성 미생물들의 성장을 억제하는 길항작용을 함으로써, 고등 식물과 공생관계를 이룬다는 것이 알려져 있다[6].
엽권에서의 효모 분포는 지정학적 위치, 기후조건, 계절, 식물의 종류 그리고 식물 기관과 관련이 있는것으로 알려져 있다[5]. 본 연구는 대전시 서구 만년동에위치한 대전 한밭 수목원의 효모분포를 조사함으로써, 새로운 효모 자원을 확보함과 동시에 수목원에서 특정식물과 효모의 공생관계를 연구하기 위한 기초 자료를 확보하고자 수행하였다.효모를 분리하기 위해, 대전 시립 한밭수목원에서 2013년 개화한 꽃과 과일을 봄과 가을에 걸쳐 채취하였다. 멸균된 증류수 10 mL에 시료를 30분간 진탕한 후, 항생제 앰피실린(50 μg/mL)이 함유된 Yeast extract-peptone dextrose한천배지에 도말하고 30oC에서 48시간 배양함으로써, 효모균락들을 얻었다[4].
한천배지에서 균락을 이룬 효모들을동정하기 위해, LN1 (5' GCA TAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG 3')과 NL4 (5' GGT CCG TGT TTC AAG ACGG 3') 프라이머들을 이용하여 PCR 반응을 수행하여 26SrDNA의 D1/D2의 부위를 증폭하였다[4]. 증폭된 DNA를1.5%(w/v) 아가로스 젤을 이용하여 전기영동을 수행하여증폭된 DNA들을 확인한 후, 증폭된 PCR 산물은 QIAEXII 젤 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다. 회수한DNA의 염기서열 결정은 코스모젠텍사(Seoul, Korea)에의뢰하여, ABI 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석된 염기서열은 ClustalX2 프로그램을 사용하여 정렬하였고, 이를 NCBI가 운영하는 BLAST를 사용하여 데이터베이스에축적되어 있는 염기서열들과의 상동성을 조사하였다[4].
Table 1. List of yeast species isolated from Hanbat Arboretum, Daejeon, Korea during the spring season of 2013
본연구를 통해 얻은 효모의 염기서열 정보들은 BankIt을 통해 GenBank에 등록하였다.2013년 4월말부터 6월초까지 한밭수목원에 식재되어 있는 19종의 꽃, 6종의 유과를 채취하였고, 2013년 9월에 10종의 꽃을 수집하였다. 무균조작에 의해 제조한 이들 현탁액을 YPD한천배지에 도말하여 생성된 균락들을 분석하여,봄철에 분리한 시료로부터 10속, 24종에 속하는 효모 43균주를 분리하였다. 또한 가을철에 수집한 시료로부터 4속,7종에 속하는 효모 14균주를 분리하였다. 봄철에 채집된 꽃과 유과로부터 분리된 43 효모 균주들 중에서 Cryptococcus속이 7종 18 균주가 분리됨으로써, 가장 많이 발견되었다(Table 1). 덜꿩나무(Viburnum erosum)의 꽃 그리고 3종의과일나무인 살구나무(Prunus armeniaca var. ansu), 산당화나무(Chaenomeles lagenaria), 포도나무(Vitis vinifera)의유과로부터 Cryptococcus adeliensis가 5균주 분리되어 Cryptococcus속 중 가장 흔하게 분포하였다(Table 1). 이들 5균주 중 4균주는 기존에 보고되어 있던 서열(GenBank numberJN400746.1)과 100% 동일성을 보였으나(Table 1), 포도나무에서 분리된 HB67-1은 기존에 보고되어 있던 서열(GenBank number JN400746.1) 641뉴클레오티드와 1뉴클레오티드의 차이를 보였다. 또한 보니카(Rosa hybrida), 뜰보리수(Elaeagnus multiflora), 달기조팝나무(Spiraea prunifolia for. simpliciflora)의 꽃 그리고 산딸나무(Cornus kousa)의 유과로부터 Cryptococcus magnus가 4균주 분리되었다.이들 중 뜰보리수에서 분리된 Cryptococcus magnus HB19-5균주만이 기존에 보고되어 있던 서열(GenBank numberAY242120.1) 641뉴클레오티드와 1뉴클레오티드의 차이를보였고, 다른 3균주는 기존에 보고되어 있는 서열(GenBanknumber AY242120.1)과 100% 동일한 서열을 갖고 있었다.또한 Cryptococcus sp.가 산딸나무(Cornus kousa), 골담초(Caragana sinica), 뜰보리수(Elaeagnus multiflora), 그리고매실유과(Prunus mume)로부터 4균주 분리되었다. 이들 중매실유과에서 분리된 Cryptococcus sp. HB32-2 균주만이 기존에 보고되어 있던 서열(GenBank number JQ327851.1)과 100% 동일한 서열을 갖고 있었으며, 산딸나무에서 분리한 HB18-2 균주는 GenBank JQ327851.1 서열과 3뉴클레오티드 차이를, 골담초에서 분리된 HB22-2 균주는 Gen-Bank GQ181171.1 서열과 1뉴클레오티드의 차이를, 그리고 뜰보리수에서 분리된 HB31-3 균주는 GenBank JX067803.1서열과 10뉴클레오티드의 차이를 보였다.
2013년 9월에 수집한 10종의 꽃으로부터 4속, 7종에 속하는 효모 14균주를 분리하였다. 이들 중 Pseudozyma aphidis가 가장 흔하게 분리되는 효모였는데, 봉숭아(Impatiensbalsamina), 애플민트(Mentha suaveolens), 상록패랭이(Dianthuschinensis var. chinensis), 도라지(Platycodon grandiflorum),오갈피나무(Acanthopanax sessiliflorus), 꽃범의꼬리(Physostegia virginiana) 등 6종의 꽃으로부터 Pseudozymaaphidis 7균주가 분리되었다. 이들 중 꽃범의꼬리에서 분리된 Pseudozyma aphidis HB94-2는 기존에 보고되어 있던 서열(GenBank number JN940520.1)과 645뉴클레오티드 중 2뉴클레오티드가 차이가 있었으며, 나머지 6균주는기존에 보고되어 있던 서열(GenBank number JN940520.1)과 100%의 동일성을 보였다(Table 2). Pseudozyma aphidis는 생물계면활성제인 mannosylerythritol 지질을 생성한다는 사실이 잘 알려져 있다[7].
Table 2. List of yeast species isolated from Hanbat Arboretum, Daejeon, Korea during the fall season of the year of 2013
또한 최근에는 이들이 식물방어시스템을 유도하는 역할을 하기 때문에, 병원균을 생물제어하기 위해 사용하려는 연구가 진행되고 있다[8]. 흥미 있는 사실은 봄철에 분리된 효모 43균주와 가을에 분리된 14균주들 중 중첩되는 효모가 발견되지 않았다는 사실이다. 이런 효모 분포의 차이는 봄철에 개화된 화밀의 종류와 가을철 개화된 화밀의 종류가 달라서 효모들의 서식 환경의 차이 때문에 기인된 것으로 사료된다.Kurtzman 등은 약 500종의 효모들이 갖고 있는 26SrDNA의 D1/D2 가변지역을 PCR에 의해 증폭하고 이들부위가 분화된 정도를 비교하여, 동정 및 계통 분류에 사용할 수 있음을 보였다[9]. 이들은 26S rDNA의 D1/D2 지역의 뉴클레오티드는 약 600여개에 해당하는데, 이 지역에서 약 1% 이상의 차이를 보이는 효모들은 다른 종에 속할가능성이 크며, 0-3 뉴클레오티드 차이가 있는 균주들은동종이거나 아니면 자매 종일 가능성이 있다고 제안하였다[8]. 이러한 관점에서 한밭수목원에서 분리한 효모 57균주들 중, Candida pimensis HB30-1 (532/539, 98.7%), Cryptococcussp. HB31-3 (532/539, 98.4%), Lachancea thermothermotolerans HB33-1 (605/615, 98.3%), Rhodotorula hinnulea HB62-2 (621/631, 98.4%), Metschnikowia pulcherrima HB85-5 (526/539, 97.5%) 등 5균주들은 GenBank 데이터베이스에 보고되어 있는 염기서열들과 1% 이상의 뉴클레오티드 차이가 발견된 것들로서, 신종일 가능성이 매우 크다고사료된다. 따라서 이들이 신종인가 여부를 정확하게 판단하기 위하여, 추가적인 연구가 수행되어야 할 것이다.
적 요
효모는 엽권의 중요한 서식자이지만, 효모의 분포와 역할을 정확하게 이해하고 있지 못한 형편이다. 2013년 봄과 가을에, 대전시 서구 만년동에 위치한 한밭 수목원에 식재되어 있는 각종 꽃과 과일로부터 효모를 분리하였다. 분리된효모 집락을 PCR 방법에 의해 26S rDNA의 D1/D2 지역을증폭하고 염기서열을 결정한 후, BLAST를 이용하여 데이터베이스와 비교하여 효모를 동정하였다. 그 결과 29종의꽃과 6종의 과일로부터, 14속 31종에 속하는 효모를 57균주를 분리하였다. 그 결과 봄과 가을, 계절에 따라서 같은수목원에서 분리되는 효모 종에 현저한 차이가 있는 것을 발견하였다.
