Endophytic Fungal Diversity Isolated from the Root of Halophytes in Taean Peninsula

염생식물의 채집 및 곰팡이 분리

충청남도 태안반도에서 7종의 염생식물이 우점하고 군락지에서 각 15개체씩 채집하였고, 채집한 염생식물은 천일사초(Carex scabrifolia: Css), 갯질경(Limonium tetragonum: Lt), 퉁퉁마디(Salicornia europaea: Se), 나문재(Suaeda glauca: Sg), 칠면초(Suaeda japonica: Sj), 해홍나물(Suaeda maritima: Smd), 지채(Triglochin maritimum: Tm)이다(Table 1).

태안반도에 자생하는 염생식물의 뿌리 부위 토양을 제거하고, 각각 계면활성제(Tween 80)와 과염소산(Perchloric acid, 1%)을 처리하여 멸균증류수로 세척하였다. 그리고 시료에 수분을 제거하고 3~4 cm 길이로 절단하여 실험재료로 사용하였다. 세균을 억제하기 위하여 스트렙토마이신(Streptomycin, Sigam-aldrich, USA) 80 ppm을 첨가하였고, 식물뿌리에서 내생진균의 생장을 느리게 하기 위하여, hagem minimal 최소배지를 사용하여 25ºC 조건에서 배양하였다. 뿌리시료의 끝 단면에서 생장한 균사를 최소배지에서 25ºC 조건으로 배양하였다. 그리고 PDA배지에 계대배양하여 형태를 관찰하였고, 각 대표균주를 선발하여 실험에 이용하였다.

Genomic DNA의 추출

분리된 균주의 ITS염기서열의 분석을 위하여 PDB에 접종하여 25ºC 조건에서 120 rpm으로 5~7일 동안 진탕배양을 하였으며, 균체를 여과하여 동결건조를 시킨 후에 시료로 사용하였다.

Table 1. Plant taxon of halophytes collected in Taean Peninsula

내생진균류의 분자적인 동정을 위하여, 동결건조 상태인 내생진균류의 균체를 DNeasy Plant mini kit (QIAgen, Va- lencia, CA, USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. PCR증폭을 수행하기 위하여, 추출된 genomic DNA는 ITS1과 ITS4 프라이머를 사용하였고[13], PCR반응 후, 1.5% agarose gel에서 전기영동을 한 후에 UV transillumi- nator로 DNA 밴드를 관찰하였다. 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였다.

ITS염기서열 분석 및 다양성 분석

해독된 염기서열은 NCBI에 BLAST 검색을 통하여 Genbank 데이터베이스와 상동성이 높은 근연종들과 비교 및 분석을 실시하였다. 다양성 분석을 위하여 내생진균의 속(Genus)을 이용하여, Mehinick's index (D_mn) [14], Shan- non's diversity index (H') [15, 16], Simpson's index (D) [17], Simpson's diversity index (1-D) [15, 17], Margalef's richness (D_mg) [18]를 적용하였으며, 각 식물에 대한 내생진균류의 다양성을 분석하였다.

염생식물로부터 내생진균의 분리

채집한 식물은 천일사초가 약 35 cm의 지상부 길이와 꽃이 피어 있는 상태였고, 갯질경은 18~25 cm의 길이에 꽃대는 형성되지 않은 상태였으며, 퉁퉁마디는 15~19 cm 길이에 10개 이상의 마디를 형성하고 있었다. 나문재는 20~25 cm길이에 잎이 약간의 선분홍색을 나타내고 있었고, 칠면초는 약 20 cm 길이에 연한 붉은색을 나타내고 있었으며, 해홍나물은 약 25 cm 길이에 꽃대는 형성되지 않은 상태였다. 그리고 지채는 22~25 cm 길이에 꽃대는 형성되지 않은 상태였다. 각 식물 샘플을 채집하여 저온에 보관해서 실험재료로 사용하였다.

7종의 염생식물 뿌리로부터 115균주의 내생진균을 분리하였고, 형태적으로 다른 내생진균 37균주를 선발되었으며, 천일사초로부터 3균주, 갯질경으로부터 5균주, 퉁퉁마디로부터 6균주, 나문재로부터 14균주, 칠면초로부터 4균주, 해홍나물로부터 3균주, 지채로부터 2균주가 선발되었다. 내생진균의 ITS 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하여 천일사초(JX238573-JX238575), 갯질경(JX238584-JX23 8588), 퉁퉁마디(JX238638-JX238643), 나문재(JX238644-JX238657), 칠면초(JX238658-JX238661), 해홍나물(JX238 662-JX238664), 지채(JX238665-JX238666)로부터 분리된 균주들의 accession no.를 제공받았다(Table 2).

Table 2. Endophytic fungi isolated from roots of halophytes in Taean Peninsula

내생진균의 다양성 분석

천일사초에서 분리된 내생진균은 Eurotiales목(Order)의 Penicillium속, Talaromyces속과 Glomerellales목에 속하는 Verticillium속이 확인되었고, 갯질경은 Eurotiales목의 Talaromyces속, Penicillium속, Aspergillus속이 확인되었으며, 퉁퉁마디는 Eurotiales목의 Penicillium속과 Talaromyces속이 확인되었다. 나문재는 Eurotiales목의 Aspergillus속, Penicillium속, Talaromyces속, Hypocreales목에 속하는 Paecilomyces속이 확인되었으며, 칠면초는 Agaricales목의 Schizophyllum속, Hypocreales목의 Paecilomyces속, Capnodiales목의 Cladosporium속, Corticiales목의 Phanerochaete속이 확인되었다. 그리고 해홍나물은 Pleosporales목 Alternaria속, Eurotiales목의 Penicillium속과 Talaromyces속이 확인되었고, 지채는 Capnodiales목 Cladosporium속, Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다(Fig. 1). 내생진균류는 대부분 자낭균류(Ascomycota)로 확인되었으며, 담자균류(Basidiomycota)도 일부 확인되었다.

Fig. 1. Distribution of fungal isolates according to the halophytes. A) Fungal isolates at the order level. B) Fungal isolates at the genus level. Plant code: Css (Carex scabrifolia); Lt (Limonium tetragonum); Se (Salicornia europaea); Sg (Suaeda glauca); Sj (Suaeda glauca); Smd (Suaeda maritima); Tm (Triglochin maritimum).

내생진균류의 종 풍부도를 확인하기 위하여 Mehinick's index (Dmn)를 적용하였을 때, 천일사초(1.155), 갯질경(1.342), 퉁퉁마디(0.408), 나문재(1.336), 칠면초(2.000), 해홍나물(1.155), 지채(1.414)로 확인되었으며, Margalef's richness (Dmg) 다양성 지수의 적용은 천일사초(0.910), 갯질경(1.243), 퉁퉁마디(0.000), 나문재(1.516), 칠면초(2.164), 해홍나물(0.910), 지채(1.443)으로 확인되었다. 종 다양성 지수인 Shannon's diversity index (H')의 적용은 천일사초(3.296), 갯질경(1.833), 퉁퉁마디(1.386), 나문재(7.001), 칠면초(5.545), 해홍나물(3.296), 지채(0.000)으로 확인되었다. Simpson's index (D)를 적용하였을 때는 천일사초(0.000), 갯질경(0.200), 퉁퉁마디(0.400), 나문재(0.341), 칠면초(0.000), 해홍나물(0.000), 지채(0.000)으로 확인되었다. Simpson's diversity index (1-D)의 적용은 천일사초(1.000), 갯질경(0.800), 퉁퉁마디(0.000), 나문재(0.659), 칠면초(1.000), 해홍나물(1.000), 지채(1.000)으로 확인되었다(Table 3).

Table 3. Diversity index of endophytic fungi isolated from the roots of halophytes

모든 내생진균은 자낭균문과 담자균문으로 분류되었고, Agaricomycetes강, Dothideomycetes강, Eurotiomycetes강, Sordariomycetes강으로 2문, 4강, 7목, 9속으로 분류되는 것을 확인하였다. 본 연구에서 식물마다 상호관계에 있는 균류을 비교하였을 때 식물 종류에 따라 다르다는 것을 알 수가 있었다. 그리고 지역별, 식물별로 기존의 다른 연구결과와 비교하였을 때, 국내 해양성 균류는 Penicillium속이 가장 많이 우점하고 있다는 결과와 부합하였고, Aspergillus속, 그리고 Alternaria속 등의 내생진균에 대한 분포비율이 높다는 것과는 대비되는 결과를 확인하였다[7, 9].

내생진균류의 종 풍부도 지수 중에서 Menhinick's index (Dmn)를 적용했을 때 칠면초에서 지수(2.000)가 가장 높았고, 퉁퉁마디에서 가장 낮은 지수(0.408)를 나타내었다. 또한, Margalef's richness (Dmg)의 경우에는 칠면초에서 가장 높은 지수(2.164)를, 퉁퉁마디에서 가장 낮은 지수(0.000)를 나타내었다. 종 다양성 지수를 확인하기 위하여 Shannon diversity index (H')를 적용했을 때 나문재에서 가장 높은 지수(7.001)와 퉁퉁마디 및 지채에서 가장 낮은 지수(0.000)를 나타내었다. 그리고 다양한 지수에서 나문재가 높은 지수로 확인된 이유는 내생진균류의 분포가 가장 다양했기 때문인 것으로생각된다. Simpson's index (D)의 경우에는 퉁퉁마디에서 가장 높은 지수(0.400)를, 칠면초 및 지채에서 가장 낮은 지수(0.000)를 나타낸 반면에 Simpson's diversity index (1-D)를 적용했을 때에는 천일사초, 칠면초, 해홍나물와 지채에서 가장 높은 지수(1.000)를, 퉁퉁마디에서 가장 낮은 지수(0.000)를 나타내었다.

Simpson's index는 퉁퉁마디가 높은 지수로 확인된 이유는 내생진균류의 다양성은 낮으면서 특정한 속의 분포비율이 가장 높기 때문인 것으로 판단된다. Simpson's index (D)는 다양성 지수를 나타내지만, 우점종(Dominant spe- cies)에 대한 의미를 가지고 있다. 또한, Simpson's diver- sity index (1-D)는 다양성 지수에 대한 의미를 나타내지만, 균등성지수(Evenness index)에 대한 의미를 포함하고 있다. 그리고 종 다양성 지수가 높을수록 종 다양성은 높고, 반대로 종 다양성 지수가 낮을수록 종 다양성은 낮다는 것을 의미하고 있다. 본 연구는 5종류의 종 풍부도 및 종 다양성 지수를 적용하여 내생진균의 다양성을 확인하였으며, 지수마다 나타내는 식의 척도가 다르기 때문에 5종류의 지수를 사용하여 비교 및 분석을 수행하였다.

염생식물은 염, 고온 등의 척박한 환경에서 자생하고 있는 식물이고, 이들이 생장하기 위해서는 공생미생물의 도움을 받으며 식물마다 필요로 하는 물질이 다르다. 그리고 식물마다 상호관계에 있는 내생균류가 다르게 작용하며 생장발달[20], 스트레스완화[11, 21], 유용물질생산[9, 10], 면역력 강화[22, 23]를 위한 영향을 미친다. 갯벌에 자생하는 염생식물의 종은 다양하지는 않지만 그들마다 독특한 형태를 가지고 있으며, 식물뿌리 형태와 구조 등에 따라 공생미생물이 다를 것으로 생각된다[24]. 그래서 본 연구는 염생식물과 공생하는 내생진균류에 대한 다양성을 확인하고자 하였다.

본 연구는 미생물의 다양성 및 자원확보 연구의 일환으로서 태안반도 자생종인 염생식물과 상호관계에 있는 내생진균류의 배양체를 확보하였고, 국내 염 환경지역에 대한 균류 분포상과 균류자원 연구에 기초자료가 될 것이라 생각한다.